純鈦不同的表面處理后與成纖維細(xì)胞的結(jié)合情況分析,口腔科學(xué)論文

純鈦不同的表面處理后與成纖維細(xì)胞的結(jié)合情況分析,口腔科學(xué)論文種植體修復(fù)已經(jīng)成為牙列缺失、缺損的常用修復(fù)方式方法。植入患者口內(nèi)的種植體想要獲得良好的穩(wěn)定性，長(zhǎng)期行使功能，不僅需要其與骨組織嚴(yán)密整合，還要與軟組織構(gòu)成牢固的生物學(xué)封閉屏障。Puckettetal[1]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明采用不同方式方法處理種植體外表會(huì)影響成纖維細(xì)胞的黏附、增殖。然而，當(dāng)前國(guó)內(nèi)的研究基本集中在鈦種植體與骨組織的結(jié)合，與軟組織結(jié)合的研究較少。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)純鈦進(jìn)行不同的外表處理后進(jìn)行成纖維細(xì)胞與材料的共培養(yǎng)，研究細(xì)胞在不同處理外表的生長(zhǎng)情況，進(jìn)而討論更有利于與軟組織結(jié)合的種植體外表形態(tài)。1材料與方式方法1.1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備純鈦棒〔TA2,寶雞和信泰金屬有限公司〕；L-929小鼠成纖維細(xì)胞〔南京凱基生物科技發(fā)展有限公司〕；-甘油磷酸二鈉鹽五水〔國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司〕；乙酸鈣〔南京凱基生物科技發(fā)展有限公司〕；優(yōu)質(zhì)胎牛血清〔杭州四季青生物工程材料有限公司〕；DMEM〔美國(guó)Gibco公司〕；DMSO〔美國(guó)Sigma公司〕；微弧氧化相關(guān)設(shè)備〔西安理工大學(xué)自制〕；S-3400NⅡ掃描電子顯微鏡〔日本日立公司〕；超凈工作臺(tái)〔SW-CJ-1FD,蘇州凈化設(shè)備有限公司〕；CO2培養(yǎng)箱〔日本SANYO公司〕；生物倒置顯微鏡〔日本Olympus公司〕；臺(tái)式低速離心機(jī)〔中國(guó)上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠〕；酶標(biāo)儀〔美國(guó)BioTek公司〕。1.2方式方法1.2.1純鈦片的制備及分組將純鈦棒線性切割成直徑為10mm,厚為1mm的圓形鈦片試件，在流水下用耐水砂紙逐級(jí)打磨至1200#后，打磨膏拋光，依次用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗30min后枯燥備用。根據(jù)不同處理方式方法將純鈦片隨機(jī)分為光滑組、雙重酸蝕噴砂組〔先在0.5Mpa氣壓下將直徑為200m的Al2O3顆粒對(duì)鈦片外表進(jìn)行均勻的垂直噴射，距離鈦片1cm;噴砂后用去離子水超聲清洗后浸入66%HNO3與40%HF的混合液溶液中10min,取出后去離子水清洗〕、氫氟酸酸蝕噴砂組〔噴砂方式方法與雙重酸蝕噴砂組一樣，試件噴砂后去離子水超聲清洗后浸入質(zhì)量百分比為0.5%的HF溶液中10min,取出后去離子水清洗〕、微弧氧化組〔以純鈦為陽(yáng)極，不銹鋼鍋為陰極，以0.04mol/L-甘油磷酸二鈉鹽五水和0.2mol/L乙酸鈣的去離子水溶液為電解液，采用脈沖直流電源進(jìn)行微弧氧化處理。所有試件在制備完成后經(jīng)過(guò)高溫高壓消毒備用。處理參數(shù)為：電壓300V,頻率500Hz,占空比12%,處理時(shí)間為3min.處理好后的試件立即用去離子水沖洗、吹干〕。1.2.2試件外表形態(tài)觀察將不同處理外表的鈦片置于掃描電子顯微鏡下觀察外表形態(tài)。1.3成纖維細(xì)胞在不同處理外表生長(zhǎng)情況1.3.1成纖維細(xì)胞在不同試件外表的黏附將存有L-929小鼠成纖維細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出，立即放入37℃恒溫水浴箱中，快速晃動(dòng)凍存管1~2min后，取出凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，參加到含培養(yǎng)液的離心管中并以1000r/min離心5min后棄上清液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后按1∶3的比例進(jìn)行傳代，選取快速生長(zhǎng)期的第4代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞系后制成1.0105個(gè)/ml濃度的單細(xì)胞懸液。從4組中各取5片試件分別置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種單細(xì)胞懸液，每孔200參加DMEM培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清〕2ml,37℃、95%濕度、5%CO2條件下分別培養(yǎng)1、2、4h停止；PBS輕輕漂洗數(shù)次，然后每孔參加200lMTT〔5mg/ml〕和800l的DMEM培養(yǎng)液置于37℃條件下孵育4h后，棄掉孔內(nèi)上清液；參加1ml的DMSO振蕩10min,取24孔培養(yǎng)板內(nèi)液體按原順序轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，酶標(biāo)儀在490nm光波長(zhǎng)處測(cè)其光吸收值。計(jì)算各組吸光度均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以x珋s表示。1.3.2成纖維細(xì)胞在不同試件外表的增殖效果每組分別取5個(gè)試件分別置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，取第4代成纖維細(xì)胞，制成2.0105個(gè)/ml濃度的單細(xì)胞懸液，接種于試件外表，每孔200l,參加DMEM培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清〕2ml,37℃、95%濕度、5%CO2條件下分別培養(yǎng)1、3、5d停止。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞吸光度值。詳細(xì)方式方法同1.3.1.1.3.3成纖維細(xì)胞在不同試件外表的鋪展從4組中各取3片試件分別置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，取第4代成纖維細(xì)胞，制成4.0105個(gè)/ml濃度的單細(xì)胞懸液，接種于試件外表，每孔200參加DMEM培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清〕2ml,37℃、95%濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后取出。掃描電子顯微鏡觀察各組試件外表細(xì)胞的鋪展形態(tài)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)比擬組間差異。2結(jié)果2.1掃描電子顯微鏡下觀察各組外表形態(tài)光滑組試件外表無(wú)明顯凹陷；雙重酸蝕噴砂組試件外表構(gòu)成不規(guī)則的微孔構(gòu)造，試件外表可見(jiàn)Al2O3顆粒，顆粒形態(tài)不規(guī)則；氫氟酸酸蝕噴砂組外表構(gòu)成不規(guī)則淺凹坑，少量Al2O3顆粒嵌于外表之中，凹坑的邊緣較銳利，坑壁不規(guī)則；微弧氧化組經(jīng)微弧氧化處理后，外表構(gòu)成多孔樣構(gòu)造，構(gòu)成的孔隙孔徑較均勻，向內(nèi)凹陷，四周隆起，類似于火山口狀。見(jiàn)圖1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞的黏附結(jié)果細(xì)胞在培養(yǎng)1、2、4h各時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)過(guò)外表處理的粗糙外表的吸光度大于光滑外表，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕。粗糙外表的吸光度氫氟酸酸蝕噴砂組雙重酸蝕噴砂組微弧氧化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕。2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖結(jié)果細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、5d各時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)過(guò)外表處理的粗糙外表的吸光度大于光滑外表，微弧氧化組的吸光度最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕。在1、3d時(shí)間點(diǎn)吸光度氫氟酸酸蝕噴砂組雙重酸蝕噴砂組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕；在5d時(shí)，雙重酸蝕噴砂組、氫氟酸酸蝕噴砂組的吸光度類似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3.2.4各組試件外表成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)光滑組試件外表成纖維細(xì)胞呈圓形或橢圓形，偶可見(jiàn)細(xì)胞伸出細(xì)小偽足；雙重酸蝕噴砂組試件外表成纖維細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞體飽滿，伸展良好，有較多偽足伸出，試件外表可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)；氫氟酸酸蝕噴砂組試件外表細(xì)胞形態(tài)與雙重酸蝕噴砂組相類似；微弧氧化組試件外表可見(jiàn)成纖維細(xì)胞胞體飽滿，在試件外表良好鋪展，細(xì)胞之間伸出大量偽足并互相融合，細(xì)胞伸出的偽足伸入試件外表的孔隙之中，錨定在試件外表，與試件嚴(yán)密附著，試件外表存在大量細(xì)胞外基質(zhì)。見(jiàn)圖4.3討論隨著技術(shù)的不斷改良，當(dāng)前純鈦種植體修復(fù)10年的成功率已到達(dá)98.5%[2].人們將研究的重點(diǎn)主要集中于怎樣提高純鈦種植體與骨組織之間的結(jié)合[3],忽略了純鈦種植體與軟組織結(jié)合的重要性。研究[4]表示清楚種植體與軟組織結(jié)合構(gòu)成良好的生物學(xué)封閉能夠保證種植體獲得長(zhǎng)久的穩(wěn)定性。怎樣促進(jìn)種植體與軟組織之間的結(jié)合，進(jìn)一步提高種植修復(fù)的成功率已成為當(dāng)前研究的熱門(mén)之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比擬純鈦外表不同處理方式方法對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，討論更利于軟組織結(jié)合的外表處理方式方法。本實(shí)驗(yàn)中外表處理采用噴砂酸蝕法和微弧氧化法，華而不實(shí)噴砂酸蝕外表已經(jīng)成為使用最廣泛的種植體外表。經(jīng)過(guò)噴砂酸蝕處理過(guò)的種植體外表可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附與增殖[5].經(jīng)過(guò)微弧氧化處理不僅能夠獲得均勻的氧化膜，而且構(gòu)成的膜有更好的耐腐蝕性，與試件外表結(jié)合更嚴(yán)密，不易脫落[6].研究[7]表示清楚微弧氧化有良好地生物相容性，能夠與骨組織構(gòu)成良好地結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法檢測(cè)顯示微弧氧化較噴砂酸蝕更能促進(jìn)成纖維細(xì)胞早期在試件外表黏附、增殖，進(jìn)而利于軟組織與種植體的結(jié)合。掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在微弧氧化外表?yè)碛懈玫匿佌剐螒B(tài)。揣測(cè)可能是由于一些不可控因素[8]影響了噴砂酸蝕外表與細(xì)胞的結(jié)合。微弧氧化技術(shù)不僅能夠通過(guò)調(diào)整工藝參數(shù)、電解液的成分制備出具備不同特性的涂層，而且微弧氧化涂層本身所具備的多孔樣構(gòu)造能夠?yàn)槠渌锘钚砸蜃犹峁└街臻g，使微弧氧化外表具備新的功能。已有學(xué)者[9]將抗菌劑鹵代呋喃酮化合物嵌于微弧氧化的微孔中來(lái)預(yù)防種植體可能出現(xiàn)的相關(guān)感染，促進(jìn)種植體與軟組織的結(jié)合。除此之外微弧氧化技術(shù)所需操作設(shè)備成本較低、操作方式方法簡(jiǎn)單、制備效率高，能夠同時(shí)制備多個(gè)試件，合適商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。這使經(jīng)微弧氧化處理的種植體應(yīng)用于臨床成為了可能。當(dāng)然負(fù)荷、冠修復(fù)、感染及全身狀況等因素都會(huì)影響種植體與軟組織構(gòu)成良好結(jié)合，只要臨床醫(yī)師綜合考慮各方面因素才能有效提高使種植體的成功率及長(zhǎng)期使用率。以下為參考文獻(xiàn)[1]PuckettSD,LeePP,CiomborDM,etal.Nanotexturedtitaniumsurfacesforenhancingskingrowthontranscutaneousosseointegrat-eddevices[J].ActaBiomater,2018,6〔6〕：2352-62.[2]ManganoFG,ShibliJA,SammonsRL,etal.Short〔8-mm〕loc-king-taperimplantssupportingsinglecrownsinposteriorregion:aprospectiveclinicalstudywith1-to10-yearsoffollow-up[J].ClinOralImplantsRes,2020,25〔8〕：933-40.[3]孫敏，唐旭炎，吳占傲，等。鈦酸鈣涂覆的純鈦片對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020,48〔11〕：1324-05.[4]InubushiT,TanakaE,RegoEB,etal.Effectsofultrasoundontheproliferationanddifferentiationofcementoblastlineagecells[J].JPeriodontal,2008,79〔10〕：1984-90.[5]賈彥，鄧嘉胤。鈦種植體外表改性的研究現(xiàn)在狀況及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2018,13〔12〕:2321-4.[6]馬臣，王穎慧，曲立杰，等。鈦合金微弧氧化技術(shù)的研究現(xiàn)在狀況及瞻望[J].中國(guó)陶瓷工業(yè)，2007,14〔1〕：46-9.[7]WuJ,LiuZM,ZhaoXH,etal.Improvedbiologicalperformanceofmicroarc-oxidizedlow-modulusTi-24Nb-4Zr-7.9Snalloy[J].JBiomedMaterResBApplBiomater,2018,92〔2〕：298-306.[8]MartinDC,ORyanFS,IndresanoAT,etal.Characteristicsofimplantfailuresinpatientswithahistoryoforalbisphosphonatetherapy[J].JOralMaxillofacSurg,2018,68〔3〕：5