利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病品種防控葡萄病毒病

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病品種防控葡萄病毒病

葡萄是感染病毒最多的果樹。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)63種病毒入侵葡萄園（marti，2012）。中國種植的葡萄品種普遍感染病毒,部分地區(qū)帶毒率達60%以上(劉曉等,2006;王升吉等,2011)。葡萄為多年生藤本植物,受病毒侵染后終身帶毒,持久危害,且無法通過化學(xué)藥劑進行有效控制。因此培育抗病品種是防控葡萄病毒病的有效途徑之一。由于葡萄生長周期長且基因型復(fù)雜,傳統(tǒng)育種方法受到很大限制。利用基因工程技術(shù)將抗病毒基因?qū)胫参锸鞘怪@得或提高抗性的有效途徑。葡萄轉(zhuǎn)基因研究起步較晚,直到20世紀90年代Mullins等(1990)以沙地葡萄花粉為材料,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,才首次獲得了表達GUS和NPTⅡ的轉(zhuǎn)基因葡萄植株,此后葡萄遺傳轉(zhuǎn)化研究取得了較大進展。目前葡萄上采用的抗病毒目的基因多為病毒源基因,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及體細胞胚再生等方法,多種病毒外殼蛋白(Coatprotein,CP)或移動蛋白(Movementprotein,MP)基因被成功導(dǎo)入葡萄,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,且有部分植株表現(xiàn)對病毒的抗性(LeGalletal.,1994;G?llesetal.,2000;Krastanovaetal.,2000;Gambinoetal.,2005,2010;Valatetal.,2006)。高效的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系是成功獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因葡萄的關(guān)鍵,本文就葡萄再生體系、遺傳轉(zhuǎn)化方法以及抗病毒轉(zhuǎn)基因等方面的研究進展進行綜述。1接種病毒的遺傳轉(zhuǎn)化與其他植物相比,葡萄再生困難,再生率低、重復(fù)性差,導(dǎo)致其遺傳轉(zhuǎn)化進展緩慢,獲得的抗病毒轉(zhuǎn)基因植株也較少。近年來針對不同品種及不同外植體材料分別建立了再生體系。1.1再生難以生物中的植株器官發(fā)生(Organogenesis)途徑是在外植體上直接形成或通過愈傷組織間接形成不定芽。葡萄再生采用的外植體材料主要包括葉片、葉柄、莖段和花藥等。90年代初,Mullins等(1990)、Colby等(1991)及Berres等(1992)就已通過葡萄葉片、葉柄和莖段等器官獲得再生不定芽及植株。中國研究者通過器官發(fā)生途徑建立了數(shù)十個葡萄品種的再生體系,主要采用MS、B5、NN69等基本培養(yǎng)基,配合使用BA、TDZ、KT等細胞分裂素和IBA、IAA、NAA等生長素(表1)。但目前通過該途徑獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因葡萄的報道并不多。韓繼成等(2006a)以‘無核白’葉片為受體通過器官再生途徑獲得轉(zhuǎn)GFLVCP基因的再生植株。金萬梅等(2009)對葡萄器官離體再生不定芽的遺傳穩(wěn)定性進行了分析,66個再生株系中僅2個株系出現(xiàn)變異且均為愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生,所有直接再生的不定芽沒有檢測到變異,說明葡萄采用器官發(fā)生途徑,特別是直接再生不定芽的遺傳穩(wěn)定性與母株的遺傳穩(wěn)定性相一致。這為器官發(fā)生途徑進一步應(yīng)用于葡萄遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了有力支持。1.2細胞胚的誘導(dǎo)來源體細胞胚發(fā)生(Somaticembryogenesis)途徑是從植物組織上直接分化或通過胚性愈傷組織間接再生出體細胞胚。胚狀體一般源于單個細胞,更易產(chǎn)生均一的轉(zhuǎn)化克隆,并且胚性細胞再生能力強于葉片、葉柄、莖段等器官發(fā)生途徑,因此在葡萄轉(zhuǎn)基因中具有很大應(yīng)用價值,迄今所得抗病毒轉(zhuǎn)基因葡萄也大多是通過該途徑獲得的(表2)。但體細胞胚的誘導(dǎo)比不定芽誘導(dǎo)困難,一般需要轉(zhuǎn)接于幾種不同培養(yǎng)基,誘導(dǎo)過程繁瑣,需要半年甚至更長時間,誘導(dǎo)率普遍較低。因此簡化誘導(dǎo)過程、提高誘導(dǎo)率是將該途徑更好地用于葡萄遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。葡萄體細胞胚發(fā)生途徑主要是從葡萄生殖器官,如子房(Kikkertetal.,2005;López-Pérezetal.,2005;Pradoaetal.,2010)、柱頭(Morganaetal.,2004)、花藥(Gribaudoetal.,2004;Kikkertetal.,2005;Amaretal.,2007;Pradoaetal.,2010;Dhekneyetal.,2012)及整花(Gambinoetal.,2007)等獲得體細胞胚,其中又以未成熟的花藥及合子胚等更易于誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。此外也有少量研究從葉片(Martinellietal.,1993;Dhekneyetal.,2012)、葉柄(Dasetal.,2002)、卷須(Salunkheetal.,1997)和莖段(Maillotetal.,2006)等營養(yǎng)結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)體細胞胚進而獲得再生葡萄植株。王華等(2005)及楊曉明等(2006)分別建立了釀酒葡萄‘梅爾諾’和‘神索’的體細胞胚再生途徑,誘導(dǎo)率達37.5%~47.5%。Yang等(2008)采用基本培養(yǎng)基NN69以未成熟合子胚為材料,建立了‘品麗珠’等6種基因型葡萄的體細胞再生體系,并且再生植株未發(fā)生體細胞無性系變異,具有很好的遺傳穩(wěn)定性。1.3不同葉片的葉片外植體對地震再生的控制葡萄不同基因型不定芽及體細胞胚的形成能力存在差異,砧木品種比栽培品種更易產(chǎn)生不定芽,在以葉片、葉柄為外植體時,沙地葡萄和圓葉葡萄一般較易產(chǎn)生體胚,而歐洲葡萄再生出體胚的品種較少(李云等,2000)。器官發(fā)生途徑中以葉片、葉柄、莖段等材料均可再生出不定芽。李云等(2002)以葉片為外植體時頂端第1片幼嫩葉片再生效果最好,其次為第2、3片葉。以MS或NN69為基本培養(yǎng)基,BA、TDZ分別與IBA組合均能誘導(dǎo)不定芽再生,但TDZ誘導(dǎo)效果更好(袁維風等,2007;金萬梅等,2008;Zhangetal.,2011)。葉片外植體放置方式也可能造成再生能力的差異,紅地球、‘5BB’、‘Wink’等葉片近軸面接觸培養(yǎng)基再生效果較好(李云等,2002;李金鳳等,2007;Zhangetal.,2011),而‘無核白’、砧木‘1202’等葉片遠軸面接觸培養(yǎng)基更利于不定芽再生(韓繼成等,2006b;袁紅燕等,2011)。2遺傳轉(zhuǎn)化方法2.1農(nóng)桿菌外源基因轉(zhuǎn)化效率建立較好受體系統(tǒng)后,需要有效的轉(zhuǎn)化手段將外源基因?qū)胧荏w系統(tǒng),其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最多。農(nóng)桿菌通過傷口感染植物,其Ti質(zhì)粒的一段DNA可轉(zhuǎn)移進植物細胞染色體,穩(wěn)定保留并遺傳給子代,通過包含外源基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體或植物組織共培養(yǎng)可實現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不僅可用于報告基因轉(zhuǎn)化(Dasetal.,2002;Dhekneyetal.,2008;Duttetal.,2008),也可用于目的基因轉(zhuǎn)化,目前獲得的絕大多數(shù)抗病毒轉(zhuǎn)基因葡萄都是通過該方法實現(xiàn)的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率受農(nóng)桿菌活化程度、侵染時間、共培養(yǎng)時間及抗生素濃度等因素的影響。一般認為農(nóng)桿菌培養(yǎng)至菌液OD值為0.6~0.8左右時轉(zhuǎn)化能力較強(陶建敏等,2003)。李金鳳等(2009b)的研究表明葡萄砧木5BB在農(nóng)桿菌侵染4min、共培養(yǎng)2d時,不定芽再生率和GUS瞬時表達率較高。轉(zhuǎn)化過程中抗生素濃度過低易造成假陽性轉(zhuǎn)化植株,過高不利于轉(zhuǎn)化細胞生長和植株再生。葡萄組織對常用抗生素,如卡那霉素非常敏感,部分品種在卡那霉素濃度為3~10mg·L-1時葉片再生就完全受到抑制(韓繼成等,2006b;莊智敏等,2006;李金鳳等,2009b),不過有的品種再生抑制濃度可達20~50mg·L-1(孫仲序等,2003;金萬梅等,2008)。采取一些輔助手段,如共培養(yǎng)前對受體材料預(yù)培養(yǎng)以及添加乙酰丁香酮(AS)等可提高轉(zhuǎn)化效率(孫仲序等,2003;鄧杰等,2008)。傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳穩(wěn)定性好,但有時轉(zhuǎn)化效率不高。超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Sonieation-assistedagrobacterium-mediatedtransformation,SAAT),通過超聲波處理植物受體材料,利用超聲波空化效應(yīng)造成目標細胞微損傷,擴大農(nóng)桿菌的感染部位,可提高轉(zhuǎn)化效率(Trick&Finer,1997)。在葡萄轉(zhuǎn)基因中,通過超聲波處理提高了砧木‘5BB’、‘美人指’、‘霞多麗’等葡萄品種的外源基因轉(zhuǎn)化效率(鄧杰等,2008;李金鳳等,2009a;周蓓蓓等,2010);Gago等(2011)利用超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將外源基因轉(zhuǎn)入葡萄品種‘Albari?o’,用于培育抗維管束病害的轉(zhuǎn)基因植株。需要注意的是,在不同葡萄品種轉(zhuǎn)化中,超聲波處理條件需根據(jù)儀器設(shè)備和轉(zhuǎn)化材料的不同進行相應(yīng)調(diào)整和優(yōu)化才能達到最佳的轉(zhuǎn)化效果。2.2兩種外源基因結(jié)合的轉(zhuǎn)化效果基因槍法通過一種仿槍結(jié)構(gòu)裝置用表面附有外源基因的金屬顆粒轟擊受體,在瞬間力量作用下使外源基因進入植物細胞。該法已成功應(yīng)用于葡萄遺傳轉(zhuǎn)化,但多為報告基因的轉(zhuǎn)化,用裹有GUS和NPTⅡ基因的微粒轟擊葡萄胚性培養(yǎng)物,獲得了轉(zhuǎn)基因植株(Hebertetal.,1993;Kikkertetal.,1996)。Vidal等(2003)通過改良條件參數(shù)提高了基因槍法轉(zhuǎn)化效率,建立了穩(wěn)定高效的‘霞多麗’遺傳轉(zhuǎn)化體系,分別獲得了GUS、NPTⅡ和抗真菌基因共轉(zhuǎn)化植株,共轉(zhuǎn)化頻率達48%~56%,并證實外源基因在植株中獲得穩(wěn)定遺傳。此外,將基因槍法與根癌農(nóng)桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)化葡萄效果較好。Scorza等(1995,1996)先用基因槍轟擊葡萄體細胞胚兩次后再與含外源基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng),獲得導(dǎo)入報告基因、溶菌酶Shirva-1基因或番茄環(huán)斑病毒(Tomatoringspotvirus,ToRSV)CP基因的‘無核白’葡萄。不論是農(nóng)桿菌介導(dǎo)還法是基因槍法,均是將外源基因與環(huán)狀質(zhì)粒載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,將整個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入寄主,其中包含一些不必要的載體框架序列(Vectorbackbonesequence),這些序列可能影響轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化后基因表達,造成未知的生物安全問題。Vidal等(2006)首次利用最小基因表達盒(Minimalgenecassettes,MCs)技術(shù)對葡萄進行基因槍法轉(zhuǎn)化,將不含載體框架序列的線性DNA片段(僅包含啟動子+ORF+終止子)轉(zhuǎn)化‘霞多麗’,轉(zhuǎn)化效率及目的基因轉(zhuǎn)錄水平與傳統(tǒng)環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法相當,報告基因和目的基因的整合和轉(zhuǎn)錄不影響轉(zhuǎn)基因葡萄植株的表型特征,表明這一新的轉(zhuǎn)化技術(shù)具有良好的應(yīng)用潛力。3關(guān)于葡萄糖抗逆劑的研究3.1病毒cp基因在葡萄中的轉(zhuǎn)化利用病原物基因?qū)胫参铽@得抗性植株的抗病毒策略(Pathogen-derivedresistance,PDR)是植物抗病毒育種的熱點之一,也是葡萄抗病毒基因工程采用的主要策略,可利用的病毒基因,包括外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因、反義RNA、移動蛋白基因等。葡萄抗病毒基因工程中已成功導(dǎo)入的目的基因多為病毒外殼蛋白基因,如南芥菜花葉病毒(Arabismosaicnepovirus,ArMV)、葡萄鉻黃花葉病毒(Grapevinechromemosaicnepovirus,GCMV)、葡萄扇葉病毒(Grapevinefanleafvirus,GFLV)、葡萄卷葉伴隨病毒2和3(Grapevineleafrollassociatevirus2and3,GLRaV-2,GLRaV-3)、葡萄A病毒(GrapevinevirusA,GVA)和葡萄B病毒(GrapevinevirusB,GVB)等的CP基因,其次還包括GFLV和GVA等病毒的MP基因,已有10余個葡萄品種獲得轉(zhuǎn)病毒基因植株,其中大多為砧木品種(表2)。在已導(dǎo)入葡萄的目的基因中,研究最多的是GFLVCP基因。1995年Mauro等(1995)和Krastanova等(1995)就已通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其分別轉(zhuǎn)入砧木41B、SO4和歐洲葡萄以及沙地葡萄和砧木110R。此后多項研究將GFLVCP基因轉(zhuǎn)入歐洲葡萄、沙地葡萄及其他多個砧木品種(表2),Gambino等(2005,2010)還將該基因轉(zhuǎn)入‘Nebbiolo’等釀酒葡萄品種。上述轉(zhuǎn)基因葡萄均是通過體細胞胚再生途徑獲得。韓繼成等(2006a)首次以試管苗葉片為受體將GFLVCP基因轉(zhuǎn)入栽培品種‘無核白’獲得轉(zhuǎn)基因植株。LeGall等(1994)將GCMVCP基因轉(zhuǎn)入砧木110R,ELISA及Westernblot檢測表明CP獲得高水平表達。G?lles等(2000)將ArMV、GVA和GVBCP基因?qū)胱曰ㄊ诜燮贩N‘拉莎伽’及砧木110R的胚性細胞培養(yǎng)物中,并獲得再生植株。Krastanova等(2000)以5種砧木的胚性愈傷組織為受體,獲得轉(zhuǎn)GFLV、GLRaV-2和GLRaV-3CP基因的葡萄植株。目前對病毒CP基因以外的其他基因轉(zhuǎn)化的葡萄研究相對較少。Martinelli等(2002)成功將GVAMP基因正義鏈和反義鏈導(dǎo)入沙地葡萄體細胞胚中,獲得再生植株,通過4年快繁,檢測證實外源MP基因獲得穩(wěn)定插入和表達。Valat等(2006)將GFLVMP基因?qū)胝枘?1B,并從細胞水平進行了抗性評價。除完整基因外,一些反義RNA、小分子RNA等也可用于抗病毒轉(zhuǎn)基因研究。Jardak-Jamoussi等(2009)將GFLVMP基因部分片段的反向重復(fù)序列(Invertedrepeat,IR)成功導(dǎo)入本氏煙和‘ArichDressé’葡萄。天然miRNAs可通過降解mRNA及抑制翻譯等方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因沉默,人造miRNAs(amiRNA)也具有類似作用,因此近年來逐漸被用于抗病毒轉(zhuǎn)基因研究。例如,源于GVAORF1和ORF5靶標序列的amiRNA在本氏煙中瞬時表達可誘導(dǎo)對病毒的抗性(Roumietal.,2012);源于GFLVCP的amiRNA被轉(zhuǎn)入葡萄體細胞胚并獲得瞬時表達,為基于amiRNA策略的葡萄抗病毒研究奠定了基礎(chǔ)(Jellyetal.,2012)。3.2菌株抗性分析目前已獲得多種轉(zhuǎn)病毒基因的葡萄植株,其中部分轉(zhuǎn)基因品種的抗病性得到初步評價。從細胞水平來講,目的基因的導(dǎo)入會降低轉(zhuǎn)基因葡萄植株內(nèi)相關(guān)病毒基因或蛋白的積累水平。Valat等(2006)采用原生質(zhì)體電穿孔法(Protoplastelectroporation)從細胞水平對導(dǎo)入GFLVCP、MP基因的葡萄砧木41B進行了抗性評價,證實部分轉(zhuǎn)基因葡萄可抑制病毒MP或CP積累,并且MP的抑制效果受作用對象、接種劑量等因素影響。從植株表現(xiàn)來看,GFLVCP轉(zhuǎn)基因植株的抗性效果在不同條件下存在差異,在田間以線蟲自然傳播GFLV時,3/18的轉(zhuǎn)基因葡萄株系對GFLV表現(xiàn)抗性,而在溫室通過嫁接法接種GFLV時,所有轉(zhuǎn)基因葡萄雖未表現(xiàn)扇葉病癥狀,但ELISA均檢測到病毒存在,造成這種抗性差異的原因與接種劑量及砧木、苗木生長狀況有關(guān)(Vigneetal.,2004;Gambinoetal.,2010)。由于在葡萄上檢測轉(zhuǎn)基因植株抗性周期長、難度大,因此多項研究選擇煙草等模式植物進行抗性評價。導(dǎo)入葡萄病毒CP基因的本氏煙對同源病毒普遍具有抗性,表現(xiàn)為抗病(植株在整個試驗期間均無癥狀)或耐病(植株發(fā)病延遲或癥狀減弱)兩種類型(Radian-Sadeetal.,2000;Lingetal.,2008)。G?lles等(2000)獲得的轉(zhuǎn)GFLVCP基因本氏煙(Nicotianabenthamiana)接種病毒表現(xiàn)出抗性效果。轉(zhuǎn)化GLRaV-2CP基因的本氏煙后代也具有抗性,14/20的T1代未被病毒侵染,T2代抗性植株比例低于T1代。導(dǎo)入GFLVMPIR的T1代本氏煙也可產(chǎn)生類似的抗病、植株恢復(fù)或延遲感染等抗性表現(xiàn)(Jardak-Jamoussietal.,2009)。導(dǎo)入GVA微型復(fù)制子(Minireplicon)的轉(zhuǎn)基因煙草對GVA具有很強抗性,60%的T1代和90%~95%的T2代植株表現(xiàn)抗性,但轉(zhuǎn)基因植株對同屬另一種病毒GVB卻沒有抗性(Bruminetal.,2009),這也是采用病原物基因誘導(dǎo)抗性策略培育轉(zhuǎn)基因植株的共同缺陷。3.3轉(zhuǎn)錄后基因沉默轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)是大多病原物基因誘導(dǎo)抗性策略轉(zhuǎn)基因植物的抗病毒機制,對導(dǎo)入葡萄病毒源基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗性機理研究也證實這一觀點(Valatetal.,2006;Lingetal.,2008;Jardak-Jamoussietal.,2009)。轉(zhuǎn)GLRaV-2CP基因的本氏煙感病植株中導(dǎo)入基因RNA轉(zhuǎn)錄本高水平積累,抗病植株中未檢測到RNA轉(zhuǎn)錄本,而在初期RNA的核失控轉(zhuǎn)錄試驗中不論感病植株還是抗病植株均檢測到轉(zhuǎn)基因RNA轉(zhuǎn)錄本,表明抗性植株中穩(wěn)定態(tài)的導(dǎo)入基因RNA轉(zhuǎn)錄本被沉默,也正是通過這種機制使得這些植株表現(xiàn)對病毒的抗性,從而不被GLRaV-2侵染,且轉(zhuǎn)基因植株的病毒抗性始終與導(dǎo)入基因RNA轉(zhuǎn)錄本的低水平積累相一致。同樣,導(dǎo)入GVA微型復(fù)制子的轉(zhuǎn)基因煙草通過持續(xù)激發(fā)強烈的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,引起導(dǎo)入基因低水平積累、GFP低水平表達以及對GVA的抗性(Bruminetal.,2009)。值得注意的是,同一轉(zhuǎn)基因株系并非所有植株都具有抗性,抗性在世代間也有所不同,影響病原物基因誘導(dǎo)抗性的因素包括RNA沉默抑制子、植株發(fā)育階段、基因表達量及環(huán)境條件等(Lingetal.,2008;Winterhagenetal.,2009)。Winterhagen等(2009)培育的轉(zhuǎn)基因煙草中抗性植株比例與基因沉默植株比例相近,因此推測病毒抗性是轉(zhuǎn)入基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默所致。目前尚沒有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄后基因沉默誘導(dǎo)與siRNA無關(guān),但Winterhagen等(2009)的研究表明產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默的接種轉(zhuǎn)基因植株并不必然產(chǎn)生可達檢測水平的siRNA,可能低于檢測水平的少量siRNA即可誘導(dǎo)沉默產(chǎn)生。而Gambino等(2010)對8個轉(zhuǎn)GFLVCP基因葡萄株系的研究卻發(fā)現(xiàn),部分株系中轉(zhuǎn)入基因被沉默,但不論沉默與否,未接種植株均檢測不到小RNA,在GFLV接種后的所有轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因葡萄中均檢測到21nt的siRNA,表明是病毒侵染而非轉(zhuǎn)入基因誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默。雖然這些轉(zhuǎn)基因葡萄能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默,嫁接接種也不表現(xiàn)癥狀,但卻能檢測到病毒存在,轉(zhuǎn)入相同基因的葡萄與煙草抗性表現(xiàn)不一致,其原因還不明確。Vigne等(2004)認為轉(zhuǎn)基因葡萄對GFLV的抗性與CP表達水平不相關(guān),但已知轉(zhuǎn)基因煙草中mRNA和CP可獲得高水平表達(Spielmannetal.,2000),而大多轉(zhuǎn)基因葡萄中的mRNA和CP積累水平很低或達不到檢測水平(Vigneetal.,2004;Gambinoetal.,2005;Maghulyetal.,2006),因此不同寄主中這種基因表達調(diào)控的差異是否導(dǎo)致抗性表現(xiàn)不同,還有待于進一步研究。4加強轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性評價由于葡萄為多年生藤本植物,其生長周期長且再生困難,故與大田作物相比葡萄抗病毒基因工程進展相對緩慢,雖然獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因植株,但植株后期生長發(fā)育及抗病性評價研究較少。今后可主要從以下幾個方面開展研究:(1)葡萄再生頻率低是限制葡萄轉(zhuǎn)基因發(fā)展的關(guān)鍵因子,需建立高效穩(wěn)定的再生體系。體細胞胚是較好