微生物非培養(yǎng)技術(shù)的未知種群檢測(cè)與功能解析

歡迎各位同學(xué)批評(píng)指正！7/3/2023.馬放哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室StateKeyLaboratoryofUrbanWaterResourceandEnvironmentDept.ofEnvironmentalScienceandEngineering,HIT微生物非培養(yǎng)技術(shù)的未知種群檢測(cè)與功能解析7/3/2023.主要內(nèi)容傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述rDNA序列同源性微生物鑒定及其種群組成分析中的應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用核酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用DNA指紋圖譜技術(shù)7/3/2023.傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)

利用傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)獲得單一的微生物包括純種分離和培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程。純種分離的方法很多，可歸納為兩大類：一類是單細(xì)胞或單孢子分離；一類是單菌落分離。7/3/2023.微生物與農(nóng)業(yè)微生物與工業(yè)微生物與醫(yī)學(xué)微生物與環(huán)境保護(hù)微生物與能源開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀——微生物與人類社會(huì)7/3/2023.

在分子生物學(xué)誕生的20多年時(shí)間里，人們運(yùn)用基因工程的幾大基本技術(shù)：凝膠電泳技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)及基因定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用微生物進(jìn)行基因改造，實(shí)現(xiàn)了人為改造或修飾生物遺傳特性并創(chuàng)造生物新性狀的夢(mèng)想。傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀——微生物與現(xiàn)代分子生物學(xué)7/3/2023.基因改造后的工程菌野生菌株基因改造技術(shù)工程菌性能YarrowialipolyticaDC-3-2N+離子束注入誘變育種對(duì)油脂的降解率提高了11.09%Sphingomonassp.BHC-A轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)同源重組獲得了降解有機(jī)磷農(nóng)藥的功能Candidatropicalis

和Candidalipolytica電融合融合菌的耐pH及耐高濃度鉻的能力均優(yōu)于親本菌工業(yè)用釀酒酵母HDY-01基因敲除乙醇產(chǎn)量降低，適于生產(chǎn)低醇啤酒Chaetomiumcupreum多點(diǎn)突變提高幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量Bacillusthuringiensis定點(diǎn)突變提高對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)甜菜夜蛾的毒力傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)7/3/2023.傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是可以利用16SrRNA技術(shù)鑒定純培養(yǎng)物種的歸屬，大大豐富了我們所獲得的環(huán)境微生物種類及遺傳多樣性。從分子水平上對(duì)微生物進(jìn)行基因研究，為探索微生物個(gè)體以及群體間作用的奧秘提供了新的線索和思路。

7/3/2023.

純培養(yǎng)技術(shù)使得研究者擺脫了多種微生物共存的復(fù)雜局面，從而能夠不受干擾地對(duì)單一菌落進(jìn)行研究，確保了人類對(duì)微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和遺傳特性的認(rèn)識(shí)。但是，隨著研究的不斷進(jìn)行，這一技術(shù)暴露出巨大的局限性——平板計(jì)數(shù)異常(PlateCountanomaly)，即環(huán)境中微生物實(shí)際數(shù)量同平板菌落計(jì)數(shù)之間存在巨大差異。傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)7/3/2023.造成平板計(jì)數(shù)異常的原因：由于實(shí)驗(yàn)室難以再現(xiàn)微生物的自然生存條件大種群微生物易形成優(yōu)勢(shì)種進(jìn)而抑制了小種群的生長(zhǎng)

傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)

因此，利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)總是重復(fù)篩選到相同的微生物，而多數(shù)難以被常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法培養(yǎng)的微生物被稱為未培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物(UnculturedMicroorganism)。7/3/2023.微生物的自然多樣性結(jié)構(gòu)多樣性代謝多樣性行為多樣性進(jìn)化多樣性生態(tài)多樣性傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)土壤海洋腸道7/3/2023.傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn)

科學(xué)家根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)推測(cè)微生物種類數(shù)目應(yīng)該在105-106。采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)對(duì)不同生境微生物可培養(yǎng)性的驗(yàn)證來(lái)看，海水中可培養(yǎng)的微生物約占0.001%-0.1%，淡水約占0.25%，土壤約占0.3%，活性污泥約占1%-15%左右。許多實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，有些微生物處于一種活的但不可培養(yǎng)(ViablebutNonculturable，VBNC)的狀態(tài)。據(jù)報(bào)道，至少有16個(gè)屬的30種細(xì)菌屬于此類微生物。

因此，純培養(yǎng)技術(shù)的局限性已經(jīng)成為研究微生物自然生態(tài)和多樣性的主要瓶頸，這迫使我們不得不重新審視傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)。

7/3/2023.The‘omics’組學(xué)技術(shù)GenomeTranscriptomeProteomeMetabolome現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述系統(tǒng)生物學(xué)7/3/2023.現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述組學(xué)技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)解析方面的應(yīng)用7/3/2023.現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述微生物非培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展

微生物學(xué)家運(yùn)用非培養(yǎng)方法來(lái)研究自然界中的微生物，即避開(kāi)傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，利用DNA含有不同的信息內(nèi)容和信息容量這一特性，直接研究細(xì)胞的DNA以獲取自然界微生物的多樣性及群落組成的信息，及從分子生態(tài)學(xué)的角度研究未培養(yǎng)微生物在環(huán)境中的變化。非培養(yǎng)技術(shù)的主要任務(wù)在于：革命性地改變了人們對(duì)原核生物多樣性和自然界微生物群落組成的理解，并提供開(kāi)發(fā)不可培養(yǎng)微生物資源的新途徑。

7/3/2023.微生物多樣性群落分析生物材料獲取

DNA-DNA復(fù)性

G+C含量分析DNA指紋分析直接PCR擴(kuò)增宏基因組技術(shù)現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述非培養(yǎng)技術(shù)的分類7/3/2023.現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述

以群落分析為目的的非培養(yǎng)技術(shù)

大尺度的分析群落DNA的非培養(yǎng)法有DNA-DNA復(fù)性和G+C含量分析兩種方法，它們能分別給出所研究微生物群落總的基因多樣性和結(jié)構(gòu)的改變。DNA指紋技術(shù)大尺度群落分析變性梯度凝膠電泳(DGGE)擴(kuò)增rDNA限制性分析(ARDRA)末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)核糖體基因間序列分析(RISA)7/3/2023.現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述以生物材料獲取為目的的非培養(yǎng)技術(shù)

1.基于目標(biāo)瞄定的PCR直接擴(kuò)增法，即不需知道基因的序列，僅根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，就可以直接從環(huán)境DNA中擴(kuò)增到目的基因，該法方便、簡(jiǎn)單、快速但不易獲得新型基因。2.宏基因組技術(shù)，即通過(guò)對(duì)環(huán)境DNA構(gòu)建插入基因組文庫(kù)，并利用活性或序列篩選的方法以獲取目標(biāo)基因的新技術(shù)。

宏基因組技術(shù)不僅可以將系統(tǒng)發(fā)育信息和未培養(yǎng)群落成員隱含的功能信息以及未被發(fā)現(xiàn)的有意義的新的功能基因聯(lián)系起來(lái)，而且還可用于共生關(guān)系或其他簡(jiǎn)單群落中未培養(yǎng)群落的全基因組測(cè)序，有利于我們重新認(rèn)識(shí)有意義但未被開(kāi)發(fā)的生物學(xué)過(guò)程。

7/3/2023.現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述微生物非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限性

微生物非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)越性

(1)發(fā)現(xiàn)新種(2)評(píng)價(jià)具有重要生態(tài)地位的種類(3)古菌的研究(4)菌種與環(huán)境功能的關(guān)聯(lián)

非培養(yǎng)技術(shù)也有其缺陷和偏差。比如，克隆文庫(kù)測(cè)序不完全，細(xì)胞裂解程度的不同、特定細(xì)胞DNA被優(yōu)先擴(kuò)增以及由PCR的循環(huán)步驟帶來(lái)的一些分析難題影響著克隆文庫(kù)的應(yīng)用。7/3/2023.現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述微生物非培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用前景

(1)微生物多樣性程度的測(cè)定(2)生態(tài)學(xué)和進(jìn)化(3)目標(biāo)基因的獲取(4)非培養(yǎng)微生物特征的鑒定(5)系統(tǒng)水平理解微生物群落動(dòng)力學(xué)7/3/2023.rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析

研究DNA多態(tài)性的最直接、有效的途徑就是測(cè)定DNA的序列，但測(cè)序是一項(xiàng)極為復(fù)雜和艱難的工作，同時(shí)也需要昂貴的設(shè)備。目前，在針對(duì)微生物研究的DNA指紋技術(shù)中，最常見(jiàn)的靶基因是16SrDNA和核糖體DNA的基因間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer，ITS)。細(xì)菌的rRNA組成7/3/2023.

細(xì)菌的23SrDNA、16SrDNA和5SrDNA分別含有約為2900個(gè)、1540個(gè)和120個(gè)呈現(xiàn)不同堿基對(duì)排列的核苷酸。rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析CarlWoese上世紀(jì)60年代末，Woese開(kāi)始采用寡核苷酸編目法對(duì)生物進(jìn)行分類，他通過(guò)比較各類生物細(xì)胞的rDNA特征序列，認(rèn)為16SrDNA及其類似的rDNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。7/3/2023.rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析rDNA序列的微生物鑒定主要依據(jù)為：rDNA是生物體細(xì)胞中必要的成分，具有功能同源性且最為古老，而且同時(shí)含有保守序列和可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)等。

7/3/2023.

用于一些DNA指紋分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是針對(duì)16SrDNA為靶基因的引物，通過(guò)它的分析可以直接鑒定到屬或種。根據(jù)核糖體16SrDNA結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，在所測(cè)定的區(qū)域中包括了V1、V2、V3、……、V8共8個(gè)高變區(qū)，尤其是V3這一高變區(qū)，由于其進(jìn)化速度相對(duì)較快，其中所包含的信息足夠用于物種屬及屬以上分類單位的比較分析。常用引物包括341F/534R（V3區(qū)）、968F/1401R（V6-V8區(qū)）、63F/534R（V1-V3區(qū)）、341F/926R（V3-V5區(qū)）等。

rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析16SrDNA7/3/2023.常用16SrDNA序列引物引物序列（5’→3’）應(yīng)用范圍27fAGAGTTTGATCNTGGCTCAGPCR測(cè)序、多數(shù)真細(xì)菌109r1ACGYGTTACKCACCCGT廣泛特異性109r2AKRCATTACTCACCCGT多數(shù)γ-紫細(xì)菌和一些β-紫細(xì)菌342rCTGCTGCSYCCCGTAG多數(shù)真細(xì)菌357rCTCCTACGGGAGGCAGCAG多數(shù)真細(xì)菌519rGWATTACCGCGGCKGCTG多數(shù)真細(xì)菌、真核生物、古菌530rGTGCCAGCMGCCGCGG多數(shù)真細(xì)菌、真核生物、古菌685r1TCTACGRATTTCACCYCTACα-紫細(xì)菌、δ-紫細(xì)菌、梭菌屬685r2TCTACGCATTTCACYGCTACα-紫細(xì)菌、γ-紫細(xì)菌685r3TCTRCGCATTYCACCGCTAC多數(shù)G+、藍(lán)細(xì)菌、混雜細(xì)菌907rCCGTCAATTCMTTTRAGTTT多數(shù)真細(xì)菌、真核生物、古菌926fAAACTYAAAKGAATTGACGG多數(shù)真細(xì)菌、真核生物、古菌1100rGGGTTGCGCTCGTTG多數(shù)真細(xì)菌1114fGCAACGAGCGCAACCC多數(shù)真細(xì)菌1392rACGGGCGGTGTGTRC多數(shù)真細(xì)菌、真核生物、古菌1406fTGYACACACCTCCCGT多數(shù)真細(xì)菌、真核生物、古菌1492rTACGGYTACCTTGTTACGACTT測(cè)序多數(shù)真細(xì)菌、古菌1525rAAGGAGGTGWTCCARCC測(cè)序多數(shù)真細(xì)菌、古菌注：M=C或A，Y=C、A或T，K=G或T，R=A或G，S=G或C，W=A或T。7/3/2023.

1980年，Brosius等利用23SrRNA基因序列測(cè)定的方法推導(dǎo)出大腸桿菌23SrRNA的全部核苷酸排列順序，整個(gè)分子含有2904個(gè)核苷酸。1981年相繼有三個(gè)實(shí)驗(yàn)室提出了大腸桿菌23SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。目前已經(jīng)獲得了大量有關(guān)23SrRNA基因序列的信息，不同來(lái)源的23SrRNA約有60%~70%的結(jié)構(gòu)共同性。大腸桿菌23SrRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與酵母也有很大相似性。雖然已有大量的大腸桿菌23SrRNA基因序列信息，但是相比于16SrRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中還沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析23SrDNA

7/3/2023.rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析核糖體DNA的基因間隔區(qū)(ITS區(qū))

細(xì)菌的rDNA通常由5S、16S和23S及一些間隔序列組成。近十幾年來(lái)，人們成功的以核糖體大小亞基基因間的間隔序列為對(duì)象，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行更細(xì)致的分類和鑒定，并對(duì)細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析。

核糖體DNA的基因間隔區(qū)示意圖7/3/2023.PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用

PCR擴(kuò)增原理示意圖（左）及PCR儀工作原理曲線（右）

DNA指紋技術(shù)通常需要大量的DNA片段，因此，需要一種手段能夠同比例的放大混合DNA樣品的量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）通過(guò)試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)使極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片段在短短幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍。7/3/2023.不同種類的PCR方法方法名稱基本原理適用范圍特點(diǎn)巢式PCR利用兩套PCR引物（巢式引物）對(duì)DNA模板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。一般應(yīng)用于動(dòng)物方面，如：病毒、梅毒螺旋體、HIV、腫瘤基因的檢測(cè)等。降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，增加了檢測(cè)的敏感性及檢測(cè)的可靠性。反向PCR用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段。僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆，曾被用于擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA。簡(jiǎn)單快速，可以研究許多獨(dú)立克隆。對(duì)條件要求較高，需優(yōu)化。原位PCR在不破壞細(xì)胞的前提下利用原位的完整細(xì)胞作為一個(gè)微反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的靶片斷的方法，是一種把PCR和原位雜交結(jié)合起來(lái)的新方法。可應(yīng)用于多種類型的研究材料（組織切片、離心細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等）的不同拷貝數(shù)目序列（病毒的或基因組的DNA或RNA）的擴(kuò)增。既有高度的敏感性，又有精確的定位。定量PCR主要利用加入PCR反應(yīng)體系中的熒光基團(tuán)或熒光染料來(lái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。已成功運(yùn)用于水資源及居家辦公環(huán)境中的大腸桿菌、藻青菌和一些寄生蟲(chóng)的檢測(cè)；轉(zhuǎn)基因生物鑒定和生物種類鑒定等方面。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、反應(yīng)后不用電泳檢測(cè)等。反轉(zhuǎn)錄PCR先用寡聚胸苷作為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，反轉(zhuǎn)錄所有mRNA成cDNA，再用擬擴(kuò)增片段兩端的兩段引物PCR擴(kuò)增該段cDNA的方法。對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量分析；測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度；鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變及呈現(xiàn)多態(tài)性等。快速靈敏。多重PCR在一個(gè)反應(yīng)管中使用多套引物，針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的方法。各類病原的檢測(cè)與鑒別、遺傳疾病診斷、以及基因缺失、突變和多態(tài)性分析等。能夠同時(shí)檢測(cè)多種目的DNA，節(jié)省樣品，操作簡(jiǎn)單。但對(duì)條件要求較高，需優(yōu)化。熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物，用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物相組合，根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物。用于分離獲得克隆載體上的DNA序列，也能夠用于基因組小的物種如擬南芥、水稻和基因組大的物種，如小麥以及哺乳動(dòng)物的已知序列兩側(cè)翼的DNA序列的分離。操作簡(jiǎn)單，特異性高，高效靈敏，快速，不涉及連接反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。但其需要的組合較多，而且有時(shí)存在假陽(yáng)性。7/3/2023.巢式PCR技術(shù)

巢式PCR原理示意圖巢式PCR(nestedPCR)，是指利用兩套PCR引物(巢式引物)對(duì)DNA模板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。7/3/2023.反向PCR技術(shù)反向PCR的原理示意圖常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩引物之間的DNA片段，反向PCR（reversePCR）是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段。7/3/2023.原位PCR技術(shù)

原位PCR可應(yīng)用于多種類型的研究材料（組織切片、離心細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等）不同拷貝數(shù)目的序列（病毒的或基因組的DNA或RNA），擴(kuò)增方法可分為單個(gè)或多個(gè)引物對(duì)，檢測(cè)系統(tǒng)也分為直接和間接兩種。原位PCR的大致流程主要包括：染色體、細(xì)胞及組織切片樣品的制備PCR前處理，包括石蠟切片、去石蠟、染色體變性和細(xì)胞穿透PCR擴(kuò)增，一般采用熱啟動(dòng)PCR，病毒RNA的擴(kuò)增需用反轉(zhuǎn)錄PCRd.原位雜交及檢測(cè)。7/3/2023.定量PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)的方法主要包括：PCR產(chǎn)物的直接定量、有限稀釋法、外對(duì)照PCR定量、內(nèi)對(duì)照PCR定量、競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量以及熒光定量PCR。其中又以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RealtimeFluorescentQuantitativePCR，RFQ-PCR）的方法應(yīng)用最為廣泛。

7/3/2023.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的兩種定量技術(shù)原理定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的動(dòng)態(tài)變化圖（左）和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（右）7/3/2023.反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

反轉(zhuǎn)錄PCR（ReversedTranscriptPCR，RT-PCR），是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合，用以分析基因表達(dá)的快速、靈敏的方法。

反轉(zhuǎn)錄PCR原理示意圖7/3/2023.熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR技術(shù)

熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，簡(jiǎn)稱TAIL-PCR）是一種用來(lái)分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。TAIL-PCR反應(yīng)流程7/3/2023.核酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用

分子雜交技術(shù)(techniqueofmolecularhybridization)又稱核酸雜交技術(shù)，是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段從分子水平探討組織細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)變化規(guī)律，并闡明細(xì)胞功能調(diào)節(jié)機(jī)制的一種極為重要的方法，在一定程度上具有其他生物檢測(cè)技術(shù)所不能替代的作用。7/3/2023.常規(guī)分子雜交技術(shù)的定義及分類菌落原位雜交分子雜交技術(shù)常規(guī)分子雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)生物芯片技術(shù)固相雜交液相雜交斑點(diǎn)雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交組織原位雜交夾心雜交DNA斑點(diǎn)雜交RNA斑點(diǎn)雜交完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交吸附雜交發(fā)光液相雜交液相夾心雜交復(fù)性速率液相分子雜交HAP吸附雜交親和吸附雜交磁珠吸附雜交能量傳遞法吖啶翁酯標(biāo)記法親和雜交采用多組合探針和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基因芯片蛋白質(zhì)芯片芯片實(shí)驗(yàn)室其他類型生物芯片cDNA微陣列芯片寡核苷酸芯片技術(shù)組織芯片細(xì)胞芯片糖芯片7/3/2023.菌落原位雜交

菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋出DNA與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)的方法。用菌落原位雜交方法進(jìn)行的FASTPlaqueTB實(shí)驗(yàn)7/3/2023.Southern印跡Southern印跡雜交的操作流程7/3/2023.熒光原位雜交技術(shù)原位雜交(InSituHybridization，ISH)技術(shù)是用標(biāo)記的核酸探針，使用非放射檢測(cè)系統(tǒng)或放射自顯影系統(tǒng)，在組織切片、細(xì)胞涂片及染色體制片上等對(duì)核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量研究的一種分子生物學(xué)方法，具有靈敏、特異、直觀等優(yōu)點(diǎn)。

ANAMMOX污泥中浮霉?fàn)罴?xì)菌熒光原位雜交分析7/3/2023.熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)的基本原理是基于堿基互補(bǔ)的原則，用熒光素標(biāo)記的已知外源DNA或RNA作探針，與待檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA相互補(bǔ)的核酸探針進(jìn)行染色體水平上的原位雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交位點(diǎn)熒光來(lái)顯示特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位。

樣品的固定樣品的制備和預(yù)處理預(yù)雜交探針和樣品變性用不同的探針雜交以監(jiān)測(cè)不同的靶序列漂洗去除未結(jié)合的探針雜交信號(hào)的檢測(cè)和結(jié)果分析FISH技術(shù)具體步驟7/3/2023.熒光原位雜交技術(shù)將中期細(xì)胞固定于玻片上將DNA變性成單鏈雙鏈DNA探針熒光標(biāo)記探針變性成單鏈探針與靶DNA雜交熒光檢測(cè)圖像獲取和分析mFISH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)路線圖7/3/2023.熒光原位雜交技術(shù)利用熒光原位雜交技術(shù)觀測(cè)鐵沉積樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)7/3/2023.生物芯片技術(shù)

生物芯片是指通過(guò)微加工和微電子技術(shù)在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及蛋白質(zhì)、核酸等生物分子進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高通量檢測(cè)。生物芯片的本質(zhì)特征是利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理以及計(jì)算機(jī)技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的樣品檢測(cè)、分析過(guò)程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化。

生物芯片各部分高度整合7/3/2023.生物芯片技術(shù)生物芯片新技術(shù)及其優(yōu)點(diǎn)核酸芯片相關(guān)的新技術(shù)優(yōu)點(diǎn)長(zhǎng)鏈探針技術(shù)特異性和靈敏度較高凝膠微陣列芯片技術(shù)固定探針能力強(qiáng)，探針?lè)肿痈子谂c目標(biāo)分子反應(yīng)，生物兼容性好侵入式探針技術(shù)操作簡(jiǎn)便，恒溫反應(yīng)，費(fèi)用低，準(zhǔn)確性高，易于自動(dòng)化和高通量操作捕獲探針技術(shù)靈敏度高，分析時(shí)間較短，成本較低固相引物延伸技術(shù)靈敏度較高，易于高通量操作電子生物芯片反應(yīng)效率較高，特異性較好LNA技術(shù)雜交特異性較好，生物學(xué)穩(wěn)定性較高PNA技術(shù)更好的結(jié)合能力和更高的特異性7/3/2023.生物芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)的原理7/3/2023.生物芯片技術(shù)cDNA微陣列芯片原理圖7/3/2023.生物芯片技術(shù)核酸編程的蛋白質(zhì)芯片制備原理7/3/2023.DNA指紋圖譜技術(shù)DNA指紋技術(shù)包括：變性梯度凝膠電泳（DGGE）溫度梯度凝膠電泳（TGGE）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）核糖體基因間隔序列分析（RISA）擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)（ARDRA）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）

7/3/2023.DNA指紋圖譜技術(shù)總DNA的提取、純化與檢測(cè)PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（或其酶切產(chǎn)物）的分離圖譜解析及數(shù)據(jù)分析等DNA指紋圖譜的建立過(guò)程示意圖總DNA提取流程示意圖7/3/2023.匹配指紋技術(shù)的電泳技術(shù)

分類依據(jù)名稱應(yīng)用分離對(duì)象蛋白質(zhì)電泳研究蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及免疫學(xué)特征核酸電泳分離、鑒定及制備純化核酸支持物瓊脂糖凝膠電泳（圖6-15a）分離、鑒定核酸及蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳（圖6-15b）分離、鑒定蛋白質(zhì)及核酸醋酸纖維膜電泳分離、鑒定蛋白質(zhì)自由溶液電泳分離、鑒定蛋白質(zhì)及核酸電泳機(jī)理等電聚焦電泳分離、鑒定蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS）凝膠電泳（圖6-15c）分離、鑒定蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)分子量雙向電泳分離、鑒定蛋白質(zhì)及細(xì)胞蛋白組成脈沖場(chǎng)電泳分離、鑒定及大病毒DNA免疫電泳分析、鑒定蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)其它轉(zhuǎn)印電泳蛋白質(zhì)的免疫學(xué)分析及核酸的分子雜交鑒定毛細(xì)管電泳分離鑒定蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、核酸及小分子化合物7/3/2023.DNA指紋圖譜技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳示意圖7/3/2023.DNA指紋圖譜技術(shù)聚丙烯酰胺電泳示意圖7/3/2023.常見(jiàn)DNA指紋技術(shù)的比較方法名稱基本原理基本步驟特點(diǎn)變性梯度凝膠電泳（DGGE）利用在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時(shí)需要不同的變性劑濃度，進(jìn)而導(dǎo)致DNA雙鏈遷移速度的不同，將不同序列DNA片段分開(kāi)，從而產(chǎn)生不同的指紋圖譜。①樣品總DNA提取及純化；②樣品16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增；③預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)化學(xué)變性劑濃度范圍進(jìn)行確定；④樣品的DGGE分析。具有重現(xiàn)性強(qiáng)、可靠性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，但該項(xiàng)技術(shù)具有對(duì)樣品預(yù)處理過(guò)程要求較高、操作較為繁瑣等局限性。溫度梯度凝膠電泳（TGGE）TGGE技術(shù)的基本原理與DGGE技術(shù)相似，變性條件由不同濃度梯度的變性劑變成溫度梯度。①樣品總DNA提取及純化；②樣品16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增；③預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)化學(xué)變性劑濃度范圍進(jìn)行確定；④樣品的DGGE分析。具有重現(xiàn)性強(qiáng)、可靠性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，但該項(xiàng)技術(shù)具有對(duì)樣品預(yù)處理過(guò)程要求較高、操作較為繁瑣等局限性。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）相同長(zhǎng)度的DNA單鏈因其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，因而電泳遷移率不同而在凝膠中被分開(kāi)，產(chǎn)生指紋圖譜。①樣品總DNA提取及純化；②樣品靶基因片段的PCR擴(kuò)增；③非變性聚丙烯酸胺凝膠電泳分離。具有操作簡(jiǎn)單；周期短；成本較低等特點(diǎn)，適合于大樣本篩查等。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）對(duì)基因組酶切片段的選擇性擴(kuò)增，將獲得的擴(kuò)增片段通過(guò)瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)，根據(jù)帶型中一些特征條帶的出現(xiàn)或消失，檢測(cè)出不同擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。①樣品總DNA提取及純化；②雙酶切及連接；③PCR預(yù)擴(kuò)增；④PCR選擇性擴(kuò)增；⑤變性聚丙烯酰膠胺凝膠電泳。具有效率、分辨率高；重復(fù)性好；操作簡(jiǎn)便；樣品用量少、適用性廣等特點(diǎn)。但存在技術(shù)費(fèi)用昂貴、對(duì)模板反應(yīng)遲鈍、在對(duì)等位基因的精確定位等方面存在一定的局限性。末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）微生物群落中任何具有特異性的DNA片段都可以作為目標(biāo)分析序列，包括微生物核糖體小亞基（SSU）16SrRNA（原核生物）和18SrRNA（真核生物）的基因序列，以及一些保守的功能基因序列等。通過(guò)對(duì)特定核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性的測(cè)定來(lái)分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。①樣品總DNA的提取；②PCR擴(kuò)增③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切；④變性聚丙烯酸胺凝膠電泳分離。具有分辨率高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)。但存在PCR差異性、無(wú)法準(zhǔn)確的分析較大量生物信息等局限性。7/3/2023.常見(jiàn)DNA指紋技術(shù)的比較核糖體基因間隔序列分析（RISA）細(xì)菌16S和23SrDNA間隔片段（ITS）的大小可因不同的物種而變化，利用PCR將ITS擴(kuò)增出來(lái)，并利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，即可產(chǎn)生RISA指紋圖譜。①樣品總DNA的提?。虎贗TS序列的PCR擴(kuò)增；③用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及解析圖譜。具有簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)；易操作等特點(diǎn)。但同時(shí)存在精度較差等缺點(diǎn)。擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)（ARDRA）一定長(zhǎng)度的DNA經(jīng)某種限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生若干不同長(zhǎng)度的小片段，其數(shù)量和每一片斷長(zhǎng)度反映了DNA上該限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的分布。這些不同的片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，根據(jù)其顯示的帶型，可以判斷樣品間的差異。①樣品總DNA提取及純化；②PCR擴(kuò)增；③限制性酶切；④用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切的DNA片段并解析圖譜。具有特異性強(qiáng)、效率高的特點(diǎn)。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）利用一系列隨機(jī)引物，以DNA為模板，通過(guò)基因放大器進(jìn)行多態(tài)性DNA片段的隨機(jī)合成。①樣品總DNA提取及純化；②隨機(jī)性PCR擴(kuò)增；③用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并解析圖譜。具有效率高、特異性強(qiáng)、樣品用量少以及檢測(cè)容易等特點(diǎn)。擴(kuò)增功能DNA限制性分析（AFDRA）對(duì)基因組中功能基因的選擇性擴(kuò)增，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)功能基因進(jìn)行酶切，后利用瓊脂糖凝膠電泳分離得到酶切片段多樣性圖譜，以判斷功能基因的多樣性。①樣品總DNA提取及純化；②利用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)功能基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；③限制性酶切；④用含有Nusieve（FMC的生物產(chǎn)物）的瓊脂糖凝膠矩陣分離酶切的DNA片段并解析圖譜。專用于功能基因多樣性的分析，具有效率高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)。但引物的設(shè)計(jì)對(duì)結(jié)果影響較大，預(yù)實(shí)驗(yàn)較為繁瑣。7/3/2023.DNA指紋圖譜技術(shù)變性梯度凝膠電泳(DGGE)DGGE的原理是：在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時(shí)需要不同的變性劑濃度，DNA雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會(huì)急劇下降，因此，將PCR擴(kuò)增得到的等長(zhǎng)DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進(jìn)行電泳，序列不同的DNA片段就會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的急劇下降，以至停留在其相應(yīng)的變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開(kāi)的條帶，每個(gè)條帶代表一個(gè)特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同序列的DNA。

7/3/2023.DNA指紋圖譜技術(shù)不同偶氮染料脫色菌群的DGGE指紋分析圖譜7/3/2023.溫度梯度凝膠電泳(TGGE)DNA指紋圖譜技術(shù)TGGE技術(shù)的基本原理與DGGE技術(shù)相似，含有高濃度甲醛