TCI 005-2022 高抗性淀粉小麥籽粒中抗性淀粉含量指標(biāo)和測(cè)定方法

ICS67.060CCSB21團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)ICS67.060CCSB21團(tuán)T/cl005—2022高抗性淀粉小麥籽粒中抗性淀粉含量指標(biāo)

和測(cè)定方法IndexanddeterminationmethodofResistantStarchContentinHigh-resistantStarchwheatvariety2022-2-8實(shí)施2022-2-82022-2-8實(shí)施T/#$%%5—2%22將o.lmLD-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.2.2,19）和3.omL的GOPOD—氨基安替比林混合液（4.2.2.18）（也可加入商用葡萄糖檢測(cè)試劑盒（GOD-PAP法）中的GOD-PAP試劑）混合?？瞻兹芤褐苽洳Ａг嚬苤屑尤?.1mL的乙酸鈉緩沖液（4.2.2.11）和3.0mL的GOPOD—氨基安替比林混合液（4.2.2.18）（也可加入商用葡萄糖檢測(cè)試劑盒（GOD-PAP法）中的GOD-PAP試齊I」）混合。試液的測(cè)定將樣品待測(cè)液（4.5.1）1500g離心10min,吸取上清液o.iomL置于玻璃試管，加入3.0mLGOPOD—氨基安替比林混合液（4.2.2.18）（也可加入商用葡萄糖檢測(cè)試劑盒（GOD-PAP法）中的GOD-PAP試劑），與D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)比色液（4.5.2）和空白試劑（4.5.3）一起放入50℃水浴20min后取出，以空白溶液（4.5.3）調(diào)零點(diǎn)，在510rlm處測(cè)定樣品待測(cè)液（4.5.1）和D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)比色液（4.5.2）的吸光度值。4.6結(jié)果計(jì)算4.6.1試樣中抗性淀粉含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3（g/100g,以干重計(jì)），計(jì)算按式（1）、式⑵進(jìn)行計(jì)算?？剐缘矸郏╣/loog樣品）（含量nio%）-xl00xl62O.lxmx1X0x1000（i）抗性淀粉（g/wog樣品）（含量＜io%）_/SAxFx10.3x100?1623-O.lxmx18（）71000（2）式中：AA——相對(duì)于空白試劑的吸光度值；F——從吸光度值到微克的轉(zhuǎn)換［在GOPOD反應(yīng)中100MgD-葡萄糖的吸光度值是確定的，F(xiàn)=100（D葡萄糖的微克數(shù)）/100MgD-葡萄糖在GOPOD反應(yīng)中的吸光度］.單位為微克（pg）；m——分析樣本的干重=稱取樣品重量x（100-含水量）/100,單位為毫克（mg）;10.3——含量＜10%樣品的最終體積，單位為毫升（mL）;162/180——從測(cè)定獲得的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)換到淀粉中存在的無結(jié)品水-D-葡萄糖的因子，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。4.6.2精密度當(dāng)樣品抗性淀粉含量v2g/100g時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的10%。當(dāng)樣品抗性淀粉含量ag/100g時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的5%。目次TOC\o"1-5"\h\z前言21范圍42規(guī)范性引用文件4GB/T1355小麥粉43術(shù)語及定義43.1抗'性淀粉Resistantstarch43.2高抗性淀粉小麥Highlyresistantstarchwheat44測(cè)定方法5\o"CurrentDocument"原理5\o"CurrentDocument"儀器和設(shè)備7\o"CurrentDocument"試樣制備7\o"CurrentDocument"分析步驟7結(jié)果計(jì)算9、/_i—刖百本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》起草。本文件由中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會(huì)提出。本文件由中國(guó)國(guó)際科技促進(jìn)會(huì)歸口。本文件起草單位：山東華田農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東國(guó)倉(cāng)健生物科技有限公司，山東農(nóng)業(yè)大學(xué),解放軍總醫(yī)院普通外科學(xué)部，山東天澤泰田種業(yè)科技有限公司，濟(jì)源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東萊州宏源面粉有限公司，泰安市谷香園食品有限公司。本文件主要起草人：田紀(jì)春，鄧志英，胥倩，于海霞，彭莉，田磊、王群青，劉振，王西振，王延訓(xùn)，楊明，張丙乾，彭濤，趙善倉(cāng)，由佳輝,呂民全，謝秀倫。本文件為首次發(fā)布，今后將根據(jù)高抗性淀粉小麥的社會(huì)需求及檢測(cè)技術(shù)發(fā)展情況適時(shí)修訂。引言小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪饕募Z食作物之一，全世界半數(shù)以上人口以其產(chǎn)品和制品為主要食品。其中淀粉是小麥籽粒中最重要的貯藏物質(zhì)，根據(jù)在小腸的可利用性，分為可消化淀粉和抗性淀粉?？剐缘矸?，又稱抗酶解淀粉或抗消化淀粉，是在胃和小腸中不能被淀粉有關(guān)酶降解為葡萄糖，利于穩(wěn)定血糖指數(shù)(GI),且在腸胃道和結(jié)腸中通過菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，利于腸蠕動(dòng)、防止便秘和結(jié)腸癌病變的一類功能淀粉，與人類的健康息息相關(guān)。前人對(duì)小麥抗性淀粉含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)普通小麥品種中抗性淀粉含量一般為0.3%-2.5%。薛芳等運(yùn)用EMS誘變技術(shù)，創(chuàng)制出抗性淀粉含量高達(dá)5.41%的小麥材料。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所夏蘭琴等利用基因編輯技術(shù)敲除鄭麥7698Bobwhite的TaS8E//a基因，獲得抗性淀粉含量分別高達(dá)6.6%和8.7%的突變體。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)田紀(jì)春團(tuán)隊(duì)關(guān)于抗性淀粉的研究，起始于2005屆付蕾博士的論文，以后又有幾名博士和碩士進(jìn)行了種質(zhì)篩選鑒定，并通過有性雜交和誘變育種，培育出多個(gè)高抗性淀粉新品系。使用本文件方法對(duì)創(chuàng)制的16份高抗性淀粉小麥品系進(jìn)行定量檢測(cè)，篩選出抗性淀粉含量高于5%的突變體材料10份，其中最高為11.8%。但是，到目前為止，國(guó)內(nèi)外至今還沒有關(guān)于高抗性淀粉小麥品種的抗性淀粉含量指標(biāo)的定義和規(guī)范，也沒有提取小麥粉中抗性淀粉的專用標(biāo)準(zhǔn)。因此，本標(biāo)準(zhǔn)將首次提出高抗性淀粉小麥品種的抗性淀粉含量指標(biāo)和測(cè)定方法，有利于培育更好的高抗性淀粉小麥新品種，對(duì)提高人民群眾生活質(zhì)量和健康水平，確保我國(guó)營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)向型農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。綜上所述，研發(fā)制定高抗性淀粉小麥籽粒中抗性淀粉含量指標(biāo)和檢測(cè)方法對(duì)行業(yè)發(fā)展是十分必要的。高抗性淀粉小麥品種和有利健康的功能食品具有廣闊的市場(chǎng)前景和良好的社會(huì)效益。高抗性淀粉小麥籽粒中抗性淀粉含量指標(biāo)和測(cè)定方法1范圍本文件規(guī)定了抗性淀粉和高抗性淀粉小麥的術(shù)語、定義、適用范圍、抗性淀粉含量指標(biāo)以及檢測(cè)方法。本文件適用于小麥種子及制品中抗性淀粉含量的定量測(cè)定。企業(yè)在制定企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)可參照使用，相關(guān)機(jī)構(gòu)在選育、審定和應(yīng)用高抗性淀粉小麥及其制品時(shí)可參照使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB1351小麥GB/T1355小麥粉3術(shù)語及定義1抗性淀粉Resistantstarch又稱抗酶解淀粉或抗消化淀粉，是指在胃和小腸中不能被淀粉有關(guān)酶降解為葡萄糖，利于降低血糖指數(shù)（GI）,且在腸胃道和結(jié)腸中通過菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，利于腸蠕動(dòng)、防止便秘和結(jié)腸癌病變的一類功能淀粉。3.2高抗性淀粉小麥Highlyresistantstarchwheat在生口發(fā)育過程中，籽粒中自然產(chǎn)生和積累的抗性淀粉含量占籽粒干重的比例*%的一類小麥品種（系）。4測(cè)定方法原理首先用胃蛋白液消化樣品，去除蛋白質(zhì)，然后用a-淀粉酶和淀粉葡萄糖苗酶(AMG)將樣品中的非抗性淀粉水解成D-葡萄糖，加入乙醇終止反應(yīng)。離心上述溶液，底部殘留絮狀團(tuán)即為抗性淀粉。將絮狀團(tuán)置于冰水浴中，加入氫氧化鉀溶液將其溶解，用AMG將抗性淀粉水解成D-葡萄糖,與葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(GOPOD)試劑會(huì)產(chǎn)生顯色反應(yīng),形成復(fù)合物，在510nm下測(cè)定其吸光度值，根據(jù)吸光度值與抗性淀粉含量成正比，計(jì)算出抗性淀粉含量。試劑和材料421試劑除非另有規(guī)定，試劑應(yīng)使用分析純?cè)噭?。水?yīng)符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。氯化鉀(KCI)o氫氧化鈉(NaOH)。氧化鉀(KOH)0二水合氯化鈣(CaCI2?2H2。)。疊氮化鈉(NaN3)。警告——疊氮化鈉為劇毒物品，操作不當(dāng)可引起爆炸。磷酸二氫鉀(KH2Po4)。濃鹽酸(HCI)o□來酸(C4HQ4)。苯甲酸(C7H6。2)。4-氨基安替比林(CnH13N3。)。對(duì)羥基苯甲酸(C7H6O3)o乙醇(CH3cH2。H)。冰乙酸(CH3coOH)。a-淀粉酶(BiOtOPPed最適溫度50℃-70℃f最適PH5.5-7.5,活性大于6000u/mg)o葡萄糖氧化酶。過氧化物酶。胃蛋白酶(BiOtopped1：3000)o淀粉葡萄糖甘酶原液AMG(3300U/mL)：直接購(gòu)買使用。該溶液在4。(：可保存5年。溶液配制4M氫氧化鈉溶液［c(NaOH)=4.0moI/L］:稱取160.0g氫氧化鈉加適量水溶解定容至1000mLo2M氫氧化鈉溶液［C(NaOH)=2.0rnoI/L］:稱取80.0g氫氧化鈉加適量水溶解后定容至1000mL。氧化鉀溶液［C(KOH)=2.0mol/L］:稱取112.2g氫氧化鉀加適量水溶解后定容至1000mLo該溶液在室溫下可保存12個(gè)月。鹽酸溶液［c(HCI)=0.1mol/L］:量取8.4mL濃鹽酸(4.2.1.7)，加適量水并稀釋至looomL。鹽酸溶液［C(HCI)=2.0mol/L］:量取180.0mL濃鹽酸(421.7)，加適量水并稀釋至1000mL。氯化鉀溶液［c(KCI)=0.1mol/L］:稱取7.35g氯化鉀，溶于適量水中并定容至looomL。氯化鉀鹽酸緩液(KCI-HCI0.1moI/L,pH1.5):向氯化鉀溶液(4.2.2.6)中加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為1.5。苯甲酸溶液［c(C6H5coOH)=0.2%］:稱取0.2g苯甲酸溶于適量水并定容至100mL?？趤硭徕c緩沖液［c(C3H3。3c00Na)=100mmoI/LzpH6.0］:稱取23.2g口來酸溶于1600mL水中，用4M氫氧化鈉溶液(422.1)調(diào)至pH為6.0,然后加入0.6g二水合氯化鈣和0.4g疊氮化鈉，最后定容至2000mL。該溶液在4℃可保存12個(gè)月。乙酸鈉緩沖液［c(CH3C00Na)=1.2moI/L,pH3.8］:量取70mL冰乙酸至800mL水中，用4M氫氧化鈉溶液(4.221)調(diào)至pH為3.8,最后定容至1000mLo該溶液在室溫下可保存12個(gè)月。乙酸鈉緩沖液［c(CH3c00Na)=100mmoI/L,pH4.5］:量取5.8mL冰乙酸至900mL水中，用4M氫氧化鈉溶液(422.1)調(diào)至pH為4.5,最后定容至1000mLo該溶液可在4。(：保存2個(gè)月。乙醇溶液［C(CH3cH2。H)=50%，體積分?jǐn)?shù)］:500mL無水乙醇加水定容至1000mLo該溶液在室溫下可保存12個(gè)月。胃蛋白酶液(10%W/V):稱取10.0g胃蛋白酶溶于鹽酸溶液(4.224)中并定容至100mL。淀粉葡萄糖苗酶使用液(300U/mL):吸取2.0mLAMG(4.2.1.19)用口來酸鈉緩沖T/#$%%5—2%22液(4.2.2.9)稀釋至22mL,分裝于聚丙烯塑料管，放于-20。(：保存。a-淀粉酶懸浮液[10mg(30U/mL)+AmG(3U/mL)]:稱取1.0ga-淀粉酶溶于100mL口來酸鈉緩沖液(4.2.2.9)中，攪拌5mino加入1.0mL淀粉葡萄糖甘酶使用液(4.2.2.14),混勻后，在離心力〉1500g離心10min,取上清液。該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。GOPOD—氨基安替比林儲(chǔ)備液：稱取136.0g磷酸二氫鉀，42.0g氫氧化鈉和30.0g對(duì)羥基苯甲酸至900mL水中溶解，用鹽酸溶液(4.225)或2M氫氧化鈉溶液(4.222)調(diào)節(jié)該溶液的PH至7.4,定容1000mL,加入1.0g疊氮化鈉，溶解混勻。該溶液于4。(2可保存3年。GOPOD—氨基安替比林緩沖液：吸取50.00mLGOPOD—氨基安替比林儲(chǔ)備液(4.2.2.16)定容至1000mLoGOPOD—氨基安替比林混合液[葡萄糖氧化酶(>12000U/L)+過氧化物酶(>650U/L)+4-氨基安替比林0.4mmoI/L]:稱取300mg葡萄糖氧化酶、4mg過氧化物酶和80mg4-氨基安替比林混合，溶于1000mLGOPOD—氨基安替比林緩沖液(4.2.2.17)中。此溶液需避光保存，-2(TC可保存1年。D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0g/L):稱取1.00gD-葡萄糖(99.5%,無結(jié)晶水)至900mL苯甲酸溶液(4.2.2.8)，定容至1000mL。室溫下密封保存時(shí)間可保5年。材料小麥籽粒。儀器和設(shè)備分析天平(±0.0001g)。離心機(jī)(3000g)opH計(jì)。旋口實(shí)驗(yàn)?zāi)?。水浴鍋。渦旋混勻器。磁力攪拌器。磁力攪拌棒(5mmxismm)。計(jì)時(shí)器。具有螺旋蓋塑料離心試管(15mL)o容量瓶(100mL,200mLz500mL,1L,2L)。溫度計(jì)[(37±0.1)；(50+0.1)℃]o玻璃試管(16mmxlOOmm)0塑料盒。移液器(200pL,1000pL)o分光光度計(jì)(能夠設(shè)定510nm,10mm路徑口度)。試樣制備小麥籽粒約50.0g,用旋口磨磨碎，然后過80目篩子，混勻后保存于廣口瓶中，密封備用。如制備小麥粉按GB/T1355標(biāo)準(zhǔn)制備。分析步驟451試液制備制備2份平行試液。準(zhǔn)確稱取干樣100mg(i5mg)樣品于帶螺旋帽試管中，輕輕拍打試管使樣品集中在底部。加入20