依諾肝素鈉藥學(xué)研究基本要求

1、發(fā)布日期20101110欄目化藥藥物評價(jià)綜合評價(jià)標(biāo)題依諾肝素鈉藥學(xué)研究資料基本要求作者余立、趙慧玲、陸益紅、張震、黃曉龍部門審評四部正文內(nèi)容 依諾肝素鈉（Enoxaparin Sodium）為低分子肝素類（low molecular weight heparin，簡稱LMWH）品種之一，EP、BP、USP等均已收載，我國也已有依諾肝素鈉注射液進(jìn)口，執(zhí)行進(jìn)口藥注冊標(biāo)準(zhǔn)（JX20000267，規(guī)格20mg/0.2ml、40mg/0.4、60mg/0.6ml、80mg/0.8ml、100mg/1.0ml）。 因依諾肝素鈉生產(chǎn)的起始原料肝素鈉為生物提取的大分子多組分生化藥，所以藥學(xué)研究申報(bào)資料除應(yīng)符合

2、化學(xué)藥品注冊分類及申報(bào)資料要求1外，還應(yīng)參考多組分生化藥注射劑技術(shù)審評基本要求2，結(jié)合該品種的特點(diǎn)重點(diǎn)注意以下方面。一制備工藝 歐洲藥典（EP）7.0版3對依諾肝素鈉制備方法簡要描述為：依諾肝素鈉是一種低分子肝素鈉鹽，它通過對豬腸粘膜肝素的芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得。專利US005389618A4即采用這種堿解聚的-消除法，其基本步驟為：以豬粘膜肝素為起始原料，經(jīng)肝素季銨鹽制備、肝素芐酯的制備、對肝素芐酯進(jìn)行堿解聚、以酸中和、醇沉淀，精制、脫色，脫水干燥，得到依諾肝素鈉成品。 由于依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)與組成比較復(fù)雜，在結(jié)構(gòu)確證與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制上存在一定的不確定性，所以起始原料和生產(chǎn)過程的研究與控制

3、就尤為重要。除按一般的化學(xué)藥要求提供工藝研究資料外，還需要重點(diǎn)提供以下信息：1起始原料的來源和質(zhì)量 起始原料應(yīng)來源于豬腸粘膜，并在相關(guān)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中予以明確。 1）使用已獲批準(zhǔn)上市的肝素鈉作為起始原料 應(yīng)提供肝素鈉原料藥的批準(zhǔn)證明文件、藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、檢驗(yàn)報(bào)告、原料藥生產(chǎn)企業(yè)的營業(yè)執(zhí)照、藥品生產(chǎn)許可證、藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范認(rèn)證證書、銷售發(fā)票、供貨協(xié)議等復(fù)印件，以及有關(guān)病毒滅活方法及其選擇依據(jù)、病毒滅活驗(yàn)證資料、申報(bào)單位對肝素鈉的供應(yīng)商進(jìn)行審計(jì)的資料。 肝素鈉原料藥的雜質(zhì)控制指標(biāo)要明確。除應(yīng)符合EP7.0和中國藥典2010年版二部肝素鈉的質(zhì)量要求外5，還應(yīng)按照國家局國食藥監(jiān)辦2008142號文關(guān)于進(jìn)一

4、步加強(qiáng)肝素鈉藥品質(zhì)量檢驗(yàn)工作的通知6中的要求，采用經(jīng)過充分驗(yàn)證的分析方法檢測多硫酸軟骨素，制定合理的限度指標(biāo)，并提供測定結(jié)果。另外，專利US005389618A提示：當(dāng)肝素中含有過多高分子雜質(zhì)，如硫酸軟骨素、乙酰肝素或硫酸皮膚素等就會對肝素的解聚順序等制備過程造成不利影響，而這些雜質(zhì)可以硫酸皮膚素為指標(biāo)性物質(zhì)進(jìn)行控制，含量應(yīng)低于2.0%。 2）直接從動(dòng)物組織分離提取肝素鈉 除應(yīng)按以上要求提供肝素鈉的資料外，還應(yīng)嚴(yán)格按照多組分生化藥注射劑技術(shù)審評基本要求，從動(dòng)物源頭開始，嚴(yán)格進(jìn)行全過程的研究和控制，以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量。2工藝過程研究和驗(yàn)證 作為大分子多組分混和物類仿制藥，在起始原料來源和質(zhì)量控

5、制之后，經(jīng)過優(yōu)化篩選的、固定的工藝過程也是產(chǎn)品質(zhì)量恒定的決定性因素。所以本品的工藝研究和驗(yàn)證必須到位并以最優(yōu)的方式固化生產(chǎn)過程。 1）應(yīng)對本品的生產(chǎn)路線、工藝參數(shù)等的選擇提供充分的文獻(xiàn)依據(jù)與試驗(yàn)依據(jù)，與文獻(xiàn)不同的獨(dú)創(chuàng)之處應(yīng)重點(diǎn)詳細(xì)說明并提供相關(guān)的研究數(shù)據(jù)。 2）應(yīng)提供詳細(xì)完整的工藝描述，包括主要的生產(chǎn)設(shè)備。 3）對于生產(chǎn)路線中各步反應(yīng)條件、物料配比、中間體、副產(chǎn)物、殘留試劑的研究和過程控制等應(yīng)有盡可能詳細(xì)的摸索篩選，提供有效的監(jiān)控方法與合理的質(zhì)控指標(biāo)，確定工藝關(guān)鍵步驟并提供工藝參數(shù)控制范圍。比如肝素季銨鹽制備時(shí)銨鹽試劑的選擇及投料量配比，肝素芐酯的制備中酯化程度的控制等，其中酯化程度的控制方法

6、應(yīng)明確，因?yàn)轷セ潭葲Q定著解聚程度，影響著產(chǎn)品的分子量分布，應(yīng)通過測定肝素芐酯或酯化產(chǎn)生的苯甲醇的含量來進(jìn)行監(jiān)控等。解聚的力度控制也是工藝關(guān)鍵點(diǎn)，解聚用堿濃度、溫度、時(shí)間、物料比等必須在充分研究的基礎(chǔ)上制定明確的范圍和要求，因?yàn)檫@些參數(shù)的改變都可使產(chǎn)品的分子量及其分布、末端結(jié)構(gòu)和生物活性隨之變化。還有精制、脫色的方法選擇，程度的控制等均應(yīng)提供具體研究數(shù)據(jù)和嚴(yán)格的驗(yàn)證資料。3研究規(guī)模 應(yīng)提供已研究生產(chǎn)的各批原料藥的匯總資料（批號、批量、生產(chǎn)的時(shí)間與地點(diǎn)、質(zhì)量概況等），其中至少應(yīng)有三批樣品達(dá)到中試規(guī)模（中試生產(chǎn)的設(shè)備原理、生產(chǎn)流程等應(yīng)與大生產(chǎn)一致，且批量不低于大生產(chǎn)商業(yè)批的十分之一）。二、結(jié)構(gòu)確證

7、 EP7.0定義依諾肝素鈉是一種低分子肝素的鈉鹽，由還沒有完全定性的復(fù)雜的低聚糖組成，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是大多數(shù)組分在糖鏈的非還原端有一個(gè)4-依諾吡喃糖醛酸的結(jié)構(gòu)，15%-25%的組分在還原端有1，6酐的結(jié)構(gòu)。EP7.0規(guī)定依諾肝素鈉的平均相對分子量范圍為38005000，特征值約為4500，分子量小于2000D的級分比例應(yīng)為12.0%20.0%，2000D8000D的級分比例應(yīng)為68.0%82.0%。 因依諾肝素鈉是多組分混合物，結(jié)構(gòu)中有數(shù)目不定的重復(fù)單位和取代基，依靠現(xiàn)代技術(shù)還較難對其進(jìn)行整體的結(jié)構(gòu)確證，所以，對這一類仿制藥的結(jié)構(gòu)確證，比較認(rèn)可的、可溯性與可信度較高的首選方法，就是通過將仿制品與E

8、P提供的依諾肝素鈉權(quán)威對照品/標(biāo)準(zhǔn)品同法進(jìn)行各類波譜的比較，除圖譜均應(yīng)基本一致外，相關(guān)圖譜還應(yīng)證明仿制品具有依諾肝素鈉的特征結(jié)構(gòu)。對于確證試驗(yàn)使用的對照品/標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)提供標(biāo)簽、分析證書、樣品與標(biāo)簽的照片、購買發(fā)票等證明性材料。具體的結(jié)構(gòu)分析要求如下： （1）IR圖譜：應(yīng)該可以體現(xiàn)分子中多羥基、多氨基，有羧酸根、-CH-、-CH2的結(jié)構(gòu)，仿制品與對照品的吸收峰波數(shù)強(qiáng)度應(yīng)基本一致。 （2）UV圖譜：仿制品0.01mol/L鹽酸溶液的UV圖譜應(yīng)在231nm波長處有最大吸收，且吸收系數(shù)為14.020.0，該特點(diǎn)是依諾肝素鈉結(jié)構(gòu)中含有、不飽和羧酸的特征吸收，不同于其他低分子肝素類藥品。 （3）核磁共振：

9、仿制品與對照品核磁共振圖譜的峰型應(yīng)一致或基本一致，特別是圖譜要有碳碳雙鍵的信息，這也是依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)特征；建議在核磁共振氫譜和碳譜的測定時(shí)固定測定用溶劑，推薦采用D2O作為測試溶劑。依諾肝素鈉的核磁共振氫譜（D2O為溶劑，TSP作為內(nèi)標(biāo)）在6.0左右有特征吸收峰，為末端糖碳碳雙鍵上的質(zhì)子的特征峰，在N-乙?；盘枀^(qū)域（2.02.2ppm）內(nèi)有特征吸收，化學(xué)位移值約為2.0ppm左右，為乙酰基上的甲基峰氫信號，多硫酸軟骨素在該區(qū)域的吸收峰的化學(xué)位移值約為2.1ppm。依諾肝素鈉的核磁共振氫譜（D2O為溶劑）在01.9ppm區(qū)域內(nèi)沒有未經(jīng)鑒定的吸收峰或吸收峰非常弱。依諾肝素鈉的核磁共振碳譜（D2

10、O為溶劑）在化學(xué)位移為105108ppm（叔碳）和144147ppm（季碳）處有特征吸收峰，為末端糖雙鍵碳的特征吸收峰；在化學(xué)位移為2224ppm左右處有吸收峰，為乙?；霞谆嫉奈辗?。 （4）質(zhì)譜：應(yīng)選擇分辨率較高的適宜的質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，否則誤差較大或無信號，仿制品與對照品的圖譜應(yīng)一致或基本一致。 （5）進(jìn)行二糖譜、糖片段和寡糖序列研究，對葡糖氨/甘露糖氨比例，2位硫酸化與未硫酸化糖的比例，葡萄糖艾杜糖比例等進(jìn)行研究檢測。 （6）參照USP32附錄“依諾肝素鈉的1,6-酐衍生物檢查”7進(jìn)行還原末端1，6酐環(huán)狀結(jié)構(gòu)的研究，以進(jìn)一步為結(jié)構(gòu)確證提供有利證明。 其他如TG圖譜顯示不含結(jié)晶水，DSC

11、顯示熔點(diǎn)（熔距）不確定（與其是大分子聚合物且為組成不固定的混合物相吻合）等，也都可以作為參考信息。 如使用的對照品為從市售進(jìn)口藥依諾肝素鈉注射液中提取的精制品，應(yīng)提供詳細(xì)的提取精制方法、精制品的質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告、市售品的批號、樣品與標(biāo)簽的照片、購買發(fā)票等證明性材料。這種情況下，解析仿制品波譜是否顯示出與文獻(xiàn)報(bào)道的依諾肝素鈉一致的結(jié)構(gòu)特征比二者波譜的一致性更為重要。三、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（一）質(zhì)量研究 本品作為仿制藥，應(yīng)與原研藥進(jìn)行全面的質(zhì)量對比研究。對比最好在同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行同時(shí)同法比較。因國內(nèi)尚無依諾肝素鈉原研廠原料藥進(jìn)口，且EP7.0已有依諾肝素鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所以也可通過考察3批仿制品的質(zhì)量，然后與

12、EP7.0標(biāo)準(zhǔn)對比來確定仿制品與被仿品的質(zhì)量一致性。 質(zhì)量研究應(yīng)全面規(guī)范，應(yīng)符合相關(guān)技術(shù)要求。研究考察的范圍除EP7.0已有的依諾肝素鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所涉及的范圍外，還應(yīng)結(jié)合申報(bào)的工藝對相應(yīng)的殘留溶劑、殘留試劑、關(guān)鍵中間體、副產(chǎn)物等潛在雜質(zhì)進(jìn)行研究。按照常規(guī)藥品研發(fā)，質(zhì)量研究較為重要的一項(xiàng)是雜質(zhì)譜研究，包括各種條件強(qiáng)制降解試驗(yàn)。鑒于本品為多組分混合物，組分比例的恒定性是保證多組分混合物藥物有效性與安全性恒定的前提，否則量變就會導(dǎo)致質(zhì)變，因此，建議進(jìn)行組分組成相似度的研究與控制。 選擇的分析方法均應(yīng)按中國藥典2010年版二部附錄“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求分別進(jìn)行定性、限度或定量分析的方法

13、學(xué)驗(yàn)證。在本品質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，分子量與分子量分布和抗a因子與抗a因子活性測定是兩個(gè)較為重要的質(zhì)控指標(biāo)，即使采用的是EP7.0已收載的方法，也應(yīng)參照生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)一般原則8進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，至少應(yīng)該包括線性、范圍、重現(xiàn)性、精密度、耐用性等考察，測定使用的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與被仿制的依諾肝素鈉具有同質(zhì)性，標(biāo)尺的正確性是這兩項(xiàng)試驗(yàn)準(zhǔn)確的前提。 由于原材料為生物來源，成品中可能含有其他生化物質(zhì)，為保證注射給藥的安全，一般須進(jìn)行過敏物質(zhì)、降壓物質(zhì)、異常毒性等檢查。由于不同動(dòng)物的敏感度不同，異常毒性試驗(yàn)應(yīng)選取小鼠和豚鼠兩種動(dòng)物進(jìn)行。（二）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在EP7.0的基礎(chǔ)上，結(jié)合申報(bào)

14、的工藝增加相應(yīng)的殘留溶劑、殘留試劑、關(guān)鍵中間體、副產(chǎn)物等潛在雜質(zhì)的控制項(xiàng)目。 溶液的顏色檢查項(xiàng)EP7.0規(guī)定為“不得比最接近色調(diào)的6號比色液更深”，自擬標(biāo)準(zhǔn)至少應(yīng)與現(xiàn)行版EP水平相當(dāng)。但EP的標(biāo)準(zhǔn)比色液從三原色開始就與中國藥典標(biāo)準(zhǔn)比色液不同，直接照搬標(biāo)準(zhǔn)則國內(nèi)檢驗(yàn)不方便，建議將EP與中國藥典標(biāo)準(zhǔn)比色液借助色差計(jì)進(jìn)行比較后進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)換。同時(shí)應(yīng)結(jié)合初步穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，將樣品效價(jià)下降程度與溶液顏色變化結(jié)合考察，采用中國藥典標(biāo)準(zhǔn)比色液，制訂合理的顏色限度。 雖然EP7.0將本品的重金屬檢查限度訂為不得過百萬分之三十，但作為注射劑原料，特別是多組分大分子混合物，重金屬含量較高易產(chǎn)生絡(luò)合物使藥品在放置期

15、內(nèi)不穩(wěn)定，常見外在表現(xiàn)就是不溶性微粒增加，甚至出現(xiàn)內(nèi)源性可見異物。因此，建議結(jié)合樣品生產(chǎn)與質(zhì)控的實(shí)際水平，考慮制訂更為嚴(yán)格的限度要求。 作為注射用的多組分生化藥原料藥，涉及到多組分生化藥特性的安全性指標(biāo)應(yīng)訂入標(biāo)準(zhǔn)，如過敏物質(zhì)、降壓物質(zhì)、異常毒性等。四、穩(wěn)定性研究 應(yīng)參照中國藥典2010年版二部原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則的技術(shù)要求進(jìn)行。申報(bào)資料應(yīng)提供檢驗(yàn)方法，明確說明包裝情況和放置方式。 考察指標(biāo)要涵蓋反映藥品質(zhì)量變化趨勢的項(xiàng)目，一般應(yīng)包括：外觀性狀、酸堿度、干燥失重、溶液的澄清度與顏色、分子量分布、抗Xa因子、抗a因子和抗Xa因子/抗a因子。試驗(yàn)項(xiàng)目一般應(yīng)包括：1批樣品的影響因素試驗(yàn)（光照4500Lx、高溫60和/或40、高濕RH 92.5和/或RH75%），3批市售包裝的加速試驗(yàn)（402，RH75%）6個(gè)月，3批市售包裝的長期試驗(yàn)（252、RH60%）至少12個(gè)月。 試驗(yàn)結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)要盡可能明確、量化，要提供相應(yīng)圖譜。應(yīng)根據(jù)