紅霉素中樞擬胃動素作用及誘導室旁核cFos蛋白的表達

1、紅霉素中樞擬胃動素作用及誘導室旁核cFos蛋白的表達【摘要】 目的 探討紅霉素（EM）在中樞的擬胃動素作用及其可能的機制。方法 應用核團微量注射法，記錄清醒大鼠胃運動，觀察側腦室分別注射生理鹽水、不同劑量的EM（9.16、 45.78、 91.56 nmol）及胃動素受體拮抗劑（91.56 nmol EM+2.95 nmol GM109） 后， 對清醒自由活動大鼠胃運動的影響；應用免疫組織化學方法，觀察側腦室分別注射生理鹽水、不同劑量的EM （45.78、91.56 nmol）及胃動素受體拮抗劑（91.56 nmol EM+2.95 nmol GM109）后，大鼠室旁核（PVN）內cFos蛋白

2、的表達。結果 與生理鹽水組相比，側腦室微量注射EM后，清醒大鼠胃運動增強，增強的幅度與EM呈劑量依賴性，其中45.78 nmol EM組胃收縮幅度增加在5、10 min時差異有顯著性（F=32.14、36.24,q=3.46、2.14,P<0.01），91.56 nmol EM組胃運動幅度增加在5、10、15、20 min時差異有顯著性（F=35.3239.44,q=2.563.26,P<0.01），9.16 nmol EM組胃運動變化均無統(tǒng)計學差異。GM109可以部分阻斷91.56 nmol EM的促胃運動作用。側腦室微量注射不同劑量的EM可以誘導下丘腦室旁核神經

3、元cFos蛋白的表達，具有劑量依賴性，2.95 nmol GM109可以部分阻斷91.56 nmol EM誘導的下丘腦室旁核cFos蛋白的表達。生理鹽水組只有極低水平的cFos的表達。結論 EM側腦室注射具有胃動素樣的促進胃運動的作用，這種作用可能是通過中樞胃動素受體介導的；下丘腦室旁核可能是EM發(fā)揮中樞作用的作用部位之一。 2 / 15【關鍵詞】 紅霉素 胃動素 cfos蛋白 受體拮抗劑 室旁核 胃運動 ABSTRACTObjectiveTo study whether EM has a motilinlike effect on CNS and its possible mechanism

4、. MethodsGastric motility was recorded in conscious rats after I.C.V. microinjection of normal saline, different dosage of EM (9.16 nmol, 45.78 nmol, 91.56 nmol), and EM 91.56 nmol+GM109 2.95 nmol. The expression of cFos protein in the brain was detected with immunohistochemistry technique 90 minute

5、s after injection of normal saline, EM(45.78 nmol, 91.56 nmol), or EM 91.56 nmol+GM109 2.95 nmol into the lateral cerebroventricle.ResultsA dosedependent motilitystimulating effect of EM on the gastric motor amplitude in conscious rats was observed, the difference of amplitude between the EM 45.78 n

6、mol and NS were significant in 10 minutes after injection (F=32.14,36.24,q=3.46,2.14,P<0.01). The difference of amplitude between the EM 91.56 nmol and NS were significant in 20 minutes after the injection (F=35.32-39.44,q=2.56-3.26,P<0.001). GM109 2.95 nmol can partially blocked the s

7、timulating effect of EM 91.56 nmol on the gastric motor amplitude. I.C.V. injection of EM 45.78 nmol or EM 91.56 nmol induced the expression of cFos protein in PVN in a dosedependent manner. GM109 2.95 nmol partially blocked the effect EM 91.56 nmol on cFos expression in PVN.ConclusionI. C. V. injec

8、tion of EM has a motilitystimulating effect on gastric motor amplitude in conscious rats, which might be mediated by the central motilin receptor; I. C. V. injection of EM induces the expression of cFos protein in PVN, which indicates that one of the possible regions where EM exerts its motilinlike

9、effect is PVN. KEY WORDSerythromycin; motilin; cFos protein; receptor antagonist; PVN; gastric motility 胃動素（MT）是由22個氨基酸殘基組成的腦腸肽,在消化間期周期性釋放，誘發(fā)胃腸道消化間期的移行性運動綜合波(MMC)的相收縮活動1,2。在中樞與攝食相關的核團中如下丘腦腹內側核、下丘腦外側區(qū)、海馬、室旁核等，微量注射外源性MT可以增強清醒大鼠胃運動35。紅霉素(EM)是最早被確認的MT的外周作用擬似劑，有許多研究證明，EM在外周具有MT樣的生物學作用6,7。本實驗室在以往的實驗中觀察到，側

10、腦室注射EM會引起糖尿病大鼠胃運動增強8。但EM在正常大鼠腦內是否同外周一樣具有MT樣作用迄今未見報道。本文采用側腦室注射EM觀察清醒大鼠胃運動變化和中樞有關核團cFos蛋白表達的方法，探討EM對胃腸的作用及其機制，從而為胃腸道運動的中樞調控機制的研究以及對促胃動力藥物的開發(fā)研究提供實驗依據。 1 材料和方法 1.1 動物及分組 選用健康成年Wistar大鼠30只，體質量200250 g，雌雄不限，由青島市藥檢所提供。置25 室溫下，晝夜循環(huán)光照，自由飲水。大鼠隨機分為5組：生理鹽水組（A組）、9.16 nmol EM組（B組）、45.78 nmol EM組（C組）、91.56 nmol EM

11、組（D組）以及胃動素受體拮抗劑（91.56 nmol EM+2.95 nmol GM109）組（E組）， 每組6只。 1.2 實驗方法 1.2.1 側腦室埋管 術前動物禁食1520 h，自由飲水，80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，用耳杠將大鼠頭部固定在立體定位儀上，參照PaxisonWaston圖譜（1982），將微量注射用套管植入側腦室（AP：0.8 mm，L：1.4 mm，D：3.5 mm），牙托粉固定于顱骨。 1.2.2 胃竇部應力傳感器（應變片）植入 牙托粉凝固結實后將大鼠從立體定位架上取下，置于手術臺上，行腹部手術，暴露胃，在距幽門0.5 cm處，將應變片沿胃環(huán)

12、行肌方向縫帖于胃竇漿膜面，絕緣導線經皮下引至頸后部皮膚切口，穿出體外。術后3 d每天常規(guī)給予青霉素5萬單位，7 d后即可進行實驗。 1.2.3 清醒動物胃運動記錄 實驗開始前，動物禁食1520 h，自由飲水。實驗開始，首先將大鼠置于特制鼠籠內適應實驗室環(huán)境1 h。記錄正常大鼠胃運動，記錄時間3060 min，統(tǒng)計大鼠胃運動的幅度。觀察側腦室注射EM及GM109后5、10、15、20、25 min，清醒大鼠胃運動幅度變化率的變化。 1.2.4 cFos蛋白表達的檢測 采用免疫組化染色。胃運動記錄完畢后，快速處死大鼠，灌注取腦，冷凍切片，片厚25 m。cFos蛋白免疫組化染色（按試劑盒說明進行），

13、應用鎳鹽增強紫藍色DAB避光顯色，最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。烤箱內烘干后顯微鏡下觀察。 1.3 統(tǒng)計學分析 計量資料采用±s表示。應用SPSS 10.0統(tǒng)計學處理軟件進行均數間單因素方差分析（oneway ANOVA）、Dunnet t檢驗及t檢驗等統(tǒng)計學處理。 2 結 果 2.1 側腦室注射EM及GM109對清醒大鼠胃運動的影響 與A組比較，5、10、15、20、25 min B組胃收縮幅度變化率差異無顯著意義(F=15.9839.44，q=2.626.19，P>0.05)；C組胃收縮幅度變化率在5、10 min時差異有顯著性（q=3.46、2.14

14、,P<0.01），15 min時差異無顯著意義（q=2.13,P>0.05）；D組胃收縮幅度變化率在5、10、15、20 min時差異顯著（q=2.563.26,P<0.01），25 min時差異無顯著意義（q=1.43,P>0.05）；E組胃收縮幅度變化率在5 min時差異有顯著意義（q=3.24,P<0.01）,在10 min時差異無顯著意義（q=1.43,P>0.05）。E組與D組比較，胃運動幅度增加量下降，胃運動幅度增加持續(xù)時間縮短。但在5 min時E組雖然較D組胃運動幅度變化率下降，但兩組差別無統(tǒng)計學

15、意義(q=2.19, P>0.05)，在10 min時兩組差別有統(tǒng)計學意義（q=3.15,P<0.05）。見表1。 表1 側腦室注射EM或EM加GM109對清醒大鼠胃收縮幅度變化率的影響 2.2 側腦室注射EM及GM109對腦有關核團cFos蛋白表達的影響 A組大鼠下丘腦室旁核僅見少量cFos免疫反應陽性細胞（20.5±3.56），染色很淺。C、D組下丘腦室旁核cFos蛋白免疫反應性陽性細胞數增多（分別為70.08±5.04、95.08±8.37），表達明顯增強，染色呈深紫藍色，與A組比較，C、D組陽性細胞數增多，差異有顯著性(t=8.

16、01、8.09，P<0.01)。 3 討 論 EM是一種常用的大環(huán)內酯類抗生素，其胃腸道副作用一直是令醫(yī)生和病人頭痛的問題，但自從1984年ITOH發(fā)現EM可以誘發(fā)與MT相似的胃腸道收縮活動以來8，人們對這一古老抗生素又加以重新審視。隨后EM及其衍生物被成功地用于糖尿病胃輕癱和其他胃腸排空功能障礙的治療1。GM109是一種特異性的MT受體拮抗劑，該化合物在離體的情況下可以競爭性抑制MT誘導的兔十二指腸組織的收縮作用，并可抑制125IMT與兔胃竇或十二指腸平滑肌組織勻漿受體的結合9。在本實驗中EM側腦室注射可以使清醒大鼠胃運動增強，并呈一定的劑量依賴性。GM109可以部分阻斷這種效

17、應，提示EM可能是通過MT受體發(fā)揮其促胃運動作用。值得注意的是,與我們用MT所得的實驗結果相比5,EM發(fā)揮促胃運動效應所需的劑量要比MT大得多。可能的解釋是EM對MT受體的親和力小，用兔小腦的MT受體所做的研究表明，這種親和力EM比MT要小于大約兩個數量級9。本實驗表明,EM在中樞同在外周一樣具有激動MT受體的作用，從這點看來中樞MT同外周MT受體一樣能被EM所激活，中樞MT受體與外周MT受體在這方面的特性是相似的。 cfos癌基因是反轉錄病毒vfos癌基因的同源序列，是即早基因家族中的一員。cfos癌基因在細胞的靜息狀態(tài)下只有低水平的表達，因此細胞核內出現cFos樣免疫反應陽性表示神經元被激

18、活。本實驗結合cFos蛋白免疫組織化學染色所做工作表明，中樞注射能增強胃運動的有效劑量的EM可以誘導PVN神經元cFos蛋白的表達，并且呈劑量依賴性。推測EM可以激活PVN室旁核中某一類神經元。GM109可以部分阻斷EM的作用，說明MT受體可能介導EM對室旁核神經元的激活。雖然此結果尚不能肯定室旁核與EM中樞促胃運動作用有必然聯系，但可以認為室旁核是EM的作用部位之一。 綜上所述， EM側腦室注射，具有胃動素樣的促進清醒大鼠胃運動的作用，并且具有明顯的劑量相關性，這種作用可被MT受體拮抗劑GM109部分阻斷。EM側腦室中樞注射可以誘導PVN神經元cFos蛋白的表達，GM109可以部分阻斷這種作

19、用，提示EM在中樞的作用部位可能是室旁核，中樞的EM可通過胃動素受體的介導，激活中樞內與攝食及胃腸運動相關的神經元而發(fā)揮調控胃運動的作用，為臨床開發(fā)促胃動力藥物及改造EM等大環(huán)內酯類藥物提供有益的實驗依據。 【參考文獻】 1BOIVIN M, RAYMOND M, RIBERDY M. Plasma motilin variation during the interdigestive and digestive states in manJ. J Gastraointestinal Motility, 1990,2:240246. 2ITON Z. Changes in plasma motilin concentration and gastrointestinal contractile activity in conscious dogsJ. Am J Dig Dis, 1978,407:929935. 3唐明，張洪燕，蔣正堯，等. 中樞外源性胃動素對大鼠腦干胃相關神經元電活動及胃運動的影響J. 生理學報, 2000,52:416420. 4張愛軍，唐明，蔣正堯,等. 下丘腦外側區(qū)胃動素對大鼠胃運動的中樞調節(jié)作用J. 生理學報,