皮膚儲(chǔ)存新技術(shù)及臨床應(yīng)用

前言

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界每年大約有100萬(wàn)人因各種原因而燒（燙）傷。尤其大面積深度燒傷病人，治療是一個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過(guò)程。通常需要通過(guò)異體（種）皮片移植來(lái)覆蓋創(chuàng)面，而皮源的缺乏往往成為治療的關(guān)鍵問(wèn)題之一真皮替代物脫細(xì)胞異體真皮、人*與新鮮皮片組相比，P<0.真皮替代物脫細(xì)胞異體真皮、人0140.新鮮皮膚組織β-actin主要分布于細(xì)胞質(zhì)，顏色均勻分布,陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)，－196℃組陽(yáng)性反應(yīng)減弱，但結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)染色基本呈紅色。-196℃儲(chǔ)存皮膚β-catenin免疫組化染色×360第二部分

臨床實(shí)際應(yīng)用0190.（平均積分光密度,X±SD，n=10）未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合2周時(shí)間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，有效抑制過(guò)冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進(jìn)快速結(jié)晶，促進(jìn)玻璃化行程溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）-196℃組中橋粒結(jié)構(gòu)、數(shù)新鮮正常皮膚組織talin分布于基底細(xì)胞皮庫(kù)的意義

54年前英國(guó)人Pickerill寫下了這樣一段話：“毫無(wú)爭(zhēng)議，創(chuàng)傷整復(fù)手術(shù)成功的關(guān)鍵之一是有可供給的皮源覆蓋因創(chuàng)傷帶來(lái)的大面積皮膚缺損。實(shí)際上在某種情況下，對(duì)皮源需要超越一切。因此這啟示我們應(yīng)該注重皮膚的儲(chǔ)存與臨床應(yīng)用?！蔽以浩?kù)簡(jiǎn)介：自1973年創(chuàng)建皮庫(kù)以來(lái)，分別運(yùn)用了4℃、-20℃和-80℃低溫冰箱皮膚保存法以及液氮儲(chǔ)皮方法1987年開始速凍玻璃化儲(chǔ)皮方法儲(chǔ)存的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用

我院皮庫(kù)簡(jiǎn)介：每年異體尸體皮采集及儲(chǔ)存40余具深低溫速凍異體皮保存方法的改進(jìn)使保存皮片活力穩(wěn)定保持在70%以上，皮片移植成活率達(dá)95%以上成為亞洲最大的皮庫(kù)之一，已儲(chǔ)存了3000余具活力良好的尸體皮，供全國(guó)30個(gè)省市300多家醫(yī)院使用每年創(chuàng)利潤(rùn)數(shù)百萬(wàn)元，經(jīng)濟(jì)效益顯著我院皮庫(kù)簡(jiǎn)介：科研方面曾獲國(guó)家自然科學(xué)基金，首都醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金，八五、九五、十五、十一五全軍科研基金20余項(xiàng)；出版相關(guān)專著10余部，發(fā)表學(xué)術(shù)論著100余篇；培養(yǎng)進(jìn)修生、研究生數(shù)百人獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)6項(xiàng)第一部分皮膚的低溫儲(chǔ)存

皮膚儲(chǔ)存的基礎(chǔ)知識(shí)皮膚的結(jié)構(gòu)皮膚的功能皮膚低溫儲(chǔ)存的重要意義皮膚低溫儲(chǔ)存的理論依據(jù)皮膚的低溫?fù)p傷機(jī)制皮膚的結(jié)構(gòu)

皮膚從外到內(nèi)，由表皮、真皮和皮下組織三部分組成皮膚附件作為特化的表皮結(jié)構(gòu)也屬于皮膚的重要結(jié)構(gòu)，其中包括汗腺、皮脂腺、毛發(fā)、指甲皮膚的結(jié)構(gòu)

表皮

從上到下又分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層、基底層

真皮

分為乳頭層、網(wǎng)狀層。主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。此外皮膚附件，血管、淋巴管、神經(jīng)末梢皮膚的主要功能：保護(hù)作用感覺作用體溫調(diào)節(jié)作用分泌和排泄作用吸收作用水分電解質(zhì)皮膚缺失熱量蛋白質(zhì)病原體

貧血低蛋白血癥創(chuàng)面膿毒癥MODS死亡大面積燒傷病人創(chuàng)面焦痂的存在引起：

體液的丟失有害介質(zhì)釋放侵襲性感染的滋生地機(jī)體超高代謝多器官功能衰竭及并發(fā)癥皮膚儲(chǔ)存的必要性：當(dāng)大面積燒傷或皮膚缺損超過(guò)體表面積的30%時(shí)，自體供皮受限臨床實(shí)踐證明：具有活力的異體皮仍是目前最為理想的創(chuàng)面覆蓋物異體皮來(lái)源時(shí)間受限皮片的來(lái)源及種類自體皮

燒傷治療中最為常用的皮片，其來(lái)源受到供皮區(qū)的限制異種皮以豬皮多見。取材方便，但移植后排斥時(shí)間短，有時(shí)難以達(dá)到覆蓋創(chuàng)面的目的同種異體皮主要來(lái)源于成人新鮮尸體，其次為新鮮死嬰皮

皮膚的低溫儲(chǔ)存

低溫儲(chǔ)存理論依據(jù)

理論上，儲(chǔ)存溫度越低，儲(chǔ)存物活力保持的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞組織代謝越低，污染的細(xì)菌也不易繁殖異種皮以豬皮多見。皮膚不是單細(xì)胞成分，而是由表皮和真皮構(gòu)成的復(fù)合組織，由于皮膚內(nèi)的各種主要細(xì)胞成分的結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性，各種細(xì)胞代謝與營(yíng)養(yǎng)條件不同,對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)性亦有所不同。溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）排斥問(wèn)題的存在，排異組織溶痂及加重病情等大張異體皮+微粒皮制備方法目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法通過(guò)對(duì)氧耗量及琥珀酸脫氫酶活力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)玻璃化儲(chǔ)存的皮膚活力較慢凍法提高了將近20%理論上說(shuō)，體積很小的1微升純水要用106-107℃/s降溫速率才能形成玻璃態(tài)0140.海藻糖對(duì)低溫保存皮膚后β-肌動(dòng)蛋白的實(shí)驗(yàn)研究與新鮮組皮膚比較，*P<0.54年前英國(guó)人Pickerill寫下了這樣一段話：“毫無(wú)爭(zhēng)議，創(chuàng)傷整復(fù)手術(shù)成功的關(guān)鍵之一是有可供給的皮源覆蓋因創(chuàng)傷帶來(lái)的大面積皮膚缺損。1987年開始速凍玻璃化儲(chǔ)皮方法儲(chǔ)存的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用時(shí)間短，有時(shí)難以達(dá)到覆蓋創(chuàng)面的目的采用該法保存的皮膚臨床具有質(zhì)地柔軟、植皮后轉(zhuǎn)紅快、成活率高（95%左右）、存活期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)表１

皮膚儲(chǔ)存方法比較項(xiàng)目4℃-20℃-80℃-196℃

費(fèi)用少少較貴貴（補(bǔ)液氮）

保存時(shí)間(d)3-74512個(gè)月理論無(wú)限期最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70低溫?fù)p傷機(jī)制：

低溫保存關(guān)鍵在于解決低溫?fù)p傷對(duì)生物組織的影響。經(jīng)典的低溫生物學(xué)認(rèn)為在低溫條件下，細(xì)胞主要受到來(lái)自兩種因素的損傷即溶質(zhì)性損傷和胞內(nèi)冰損傷，即“兩因素”學(xué)說(shuō)“兩因素”學(xué)說(shuō)胞內(nèi)冰晶損傷

胞內(nèi)生成冰晶，長(zhǎng)大到一定程度，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是降溫速率較快時(shí)引起損傷的主要原因溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）

細(xì)胞外水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度的升高并持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間。由高滲引起細(xì)胞的損傷，是降溫速率較慢時(shí)引起損傷的主要原因“兩因素”學(xué)說(shuō)皮膚結(jié)構(gòu)與儲(chǔ)存的關(guān)系

皮膚不是單細(xì)胞成分，而是由表皮和真皮構(gòu)成的復(fù)合組織，由于皮膚內(nèi)的各種主要細(xì)胞成分的結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性，各種細(xì)胞代謝與營(yíng)養(yǎng)條件不同,對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)性亦有所不同。因此皮膚的低溫?fù)p傷是一個(gè)更為非常復(fù)雜的過(guò)程皮膚低溫?fù)p傷的其他因素

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞低溫?fù)p傷還與細(xì)胞骨架、細(xì)胞連接橋粒以及細(xì)胞間黏附的關(guān)系密切

低溫?fù)p傷的干預(yù)：玻璃化儲(chǔ)皮方法的發(fā)展抗凍液的使用玻璃化的基礎(chǔ)知識(shí)玻璃化的概念

玻璃化是一個(gè)物理學(xué)的概念，是指當(dāng)水或溶液在極快降溫到或低于-100～-110℃的溫度范圍時(shí)，形成一種具有高黏度的界于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體態(tài)的、雜亂無(wú)章的、透明的玻璃狀態(tài)玻璃化儲(chǔ)存的特點(diǎn)：

玻璃化儲(chǔ)存生物組織和細(xì)胞，由于降溫速率很快，水分沒有足夠的時(shí)間來(lái)形成冰晶，即進(jìn)入均勻的玻璃狀態(tài)。這種玻璃態(tài)的物理性能與晶體態(tài)不同，是一種既可以避免或減輕冷凍過(guò)程組織的損傷，又是同時(shí)可長(zhǎng)期保存組織的良好方法兩種方法的比較慢降溫速率冰晶形態(tài)玻璃化速凍時(shí)冰晶的形態(tài)皮膚的玻璃化儲(chǔ)存

皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，其組織和細(xì)胞內(nèi)各種酶的活力及代謝很低甚至近乎零，即所謂的“生命懸持狀態(tài)”。在此溫度下保存的皮膚理論上可無(wú)限期儲(chǔ)存

玻璃化的理想條件

理論上說(shuō)，體積很小的1微升純水要用106-107℃/s降溫速率才能形成玻璃態(tài)

皮膚玻璃化儲(chǔ)存的途徑

以水為主要成分的生物組織,實(shí)現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。目前只能采用各種方法實(shí)現(xiàn)部分玻璃化，抑制冰晶形成和長(zhǎng)大，避免細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷皮膚玻璃化儲(chǔ)存的途徑冷源問(wèn)題

目前國(guó)內(nèi)各家皮庫(kù)主要采用液氮作為冷源，溫度可達(dá)-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降溫速率可達(dá)2160℃/min皮膚玻璃化儲(chǔ)存的途徑儲(chǔ)存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來(lái)冷源溫度傳導(dǎo)困難和儲(chǔ)存不便，因此可設(shè)計(jì)成皮卷形式皮膚玻璃化儲(chǔ)存的途徑降溫速率冷卻的銅板預(yù)冷皮膚后即將其直接浸入液氮預(yù)冷銅板示意圖抗凍劑的應(yīng)用抗凍液的作用及機(jī)制：

深低溫儲(chǔ)存組織離不開抗凍液的保護(hù)，否則皮膚將受到嚴(yán)重的損傷抗凍劑的作用機(jī)制有以下兩點(diǎn)：有效抑制過(guò)冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進(jìn)快速結(jié)晶，促進(jìn)玻璃化行程緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害目前較為成熟抗凍液配方

H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇），以此作為玻璃化儲(chǔ)存皮膚的抗凍液

一般10000cm2面積的皮膚約需抗凍液3000ml30分鐘6小時(shí)內(nèi)皮片新潔爾滅生理鹽水H抗凍液玻璃化儲(chǔ)皮及使用步驟臨床使用液氮復(fù)溫40℃15’30’皮卷生理鹽水生理鹽水總結(jié)：玻璃化儲(chǔ)存皮膚的步驟異體皮的采集消毒皮膚的修整抗凍液的處理包裝快速降溫液氮容器的管理細(xì)胞膜的影響降低細(xì)胞的流動(dòng)性細(xì)胞骨架受損表皮細(xì)胞黏附率降低基底膜的破壞玻璃化對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)和功能的影響玻璃化對(duì)皮膚抗原性影響皮膚經(jīng)低溫儲(chǔ)存后，異體皮的存活時(shí)間較新鮮異體皮長(zhǎng)低溫儲(chǔ)存后皮片抗原性降低，可能與皮膚內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞（LS）數(shù)量降低有關(guān)保存溫度越低，抗原性越弱，移植后存活時(shí)間越長(zhǎng)低溫對(duì)朗格漢斯細(xì)胞的影響新鮮豚鼠皮朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量較多、呈樹突狀輪廓-196℃豚鼠皮朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量明顯減少、樹突變短異體皮勻漿免疫擴(kuò)散電泳圖右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲(chǔ)存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮小

異體皮勻漿免疫火箭電泳圖上圖為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果下圖為液氮儲(chǔ)存48h后皮片勻漿電泳結(jié)果皮膚活力的鑒定常用的皮膚活力的鑒定方法皮膚氧耗量測(cè)定法琥珀酸鈉脫氫酶測(cè)定法四氮唑鹽WST-1法SYTO/EB雙重染色法皮膚氧耗量測(cè)定法

原理：有活力的組織均有代謝耗氧恒溫營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)微電極（鉑、銀電極）與有活力的皮膚接觸，表面氧分壓下降，通過(guò)放大器測(cè)下降程度，推算出皮膚的活力，操作可在1h內(nèi)完成我院自行設(shè)計(jì)的測(cè)氧儀外觀琥珀酸脫氫酶測(cè)定法測(cè)定原理琥珀酸鈉+紅四氮唑延胡索酸+甲琥珀酸脫氫酶H+月替琥珀酸脫氫酶測(cè)定法示意圖

皮片氮?dú)忡晁徕c+紅四氮唑37℃水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力單位）四氮唑鹽WST-1法

原理:利用活組織或細(xì)胞中的線粒體琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS),作用在亞細(xì)胞呼吸鏈反應(yīng)中的還原型輔酶Ⅰ

(NADH)、NAD+(輔酶Ⅰ)脫氫反應(yīng)與細(xì)胞組織中的呼吸鏈EC(電子偶聯(lián)反應(yīng)體系)結(jié)合,將H結(jié)合到WST-1的甲氮唑苯環(huán)上,打開其四氮唑苯環(huán)而顯色四氮唑鹽WST-1法琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS)琥珀酸脫氫酶H+呼吸鏈WST-1顯色反應(yīng)SYTO/EB雙重染色法

為一種敏感、快速的皮膚活力檢測(cè)法,采用新型穿透性核酸染色劑SYTO和EB方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’

后PBS洗滌。通過(guò)488/520nm激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察玻璃化對(duì)皮膚活力的影響

通過(guò)對(duì)氧耗量及琥珀酸脫氫酶活力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)玻璃化儲(chǔ)存的皮膚活力較慢凍法提高了將近20%速凍玻璃化儲(chǔ)皮的優(yōu)點(diǎn)及效果：該法可以永久保存皮膚，儲(chǔ)存后冷凍皮片的平均活力指標(biāo)可達(dá)到新鮮皮片的70%，較以往的慢速冷凍法提高活力近20%采用該法保存的皮膚臨床具有質(zhì)地柔軟、植皮后轉(zhuǎn)紅快、成活率高（95%左右）、存活期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)第二部分

臨床實(shí)際應(yīng)用冷凍異體皮的適用范圍開放性創(chuàng)面、深度燒傷創(chuàng)面和切痂創(chuàng)面的暫時(shí)性覆蓋用于郵票、網(wǎng)狀或自體微粒皮的覆蓋移植，保證下方自體微粒皮成活用于自體皮源緊張的燒傷后期整形重建手術(shù)，作為自體微粒皮的支架用于暫不適合自體皮的創(chuàng)面覆蓋以改善創(chuàng)基情況異體皮覆蓋創(chuàng)面的意義防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失防止電解質(zhì)、蛋白質(zhì)及血細(xì)胞丟失減少創(chuàng)面污染，減輕患者疼痛有利于關(guān)節(jié)部位早日活動(dòng)保護(hù)暴露的組織，促進(jìn)肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力低溫儲(chǔ)存后抗原性降低，創(chuàng)面覆蓋時(shí)間延長(zhǎng)應(yīng)用方法大張異體皮嵌植小塊自體皮大張異體皮自體微粒皮移植目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法大張異體皮+微粒皮制備方法

第一步復(fù)溫大張異體皮+微粒皮制備方法第二步微粒皮的制備大張異體皮+微粒皮制備方法第三步漂皮創(chuàng)面處理前

切削痂后創(chuàng)面大張異體皮覆蓋創(chuàng)面

微粒皮植皮注意事項(xiàng)植皮面積與微粒皮比例自體微粒皮與異體皮的比例為1:10～1:15較好.自體皮源極度缺乏時(shí)甚至可達(dá)1:20微粒皮正反面問(wèn)題微粒皮均勻分散臨床變化異體皮發(fā)黑變干脫落創(chuàng)面愈合

移植皮片3-4天轉(zhuǎn)紅，1-2周異體皮色澤近似正常皮膚，此后呈斑點(diǎn)狀或斑片狀發(fā)黑區(qū)即為成活的自體微粒皮。4-6周異體皮壞死成干痂，但仍附著牢固，此時(shí)微粒皮融合成片，以后異體皮完全變干脫落，創(chuàng)面修復(fù)完成。未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合0140.透射電鏡下觀察CPA對(duì)低溫保存皮膚基底膜的影響自體皮燒傷治療中最為常用的皮片，其來(lái)源受皮膚低溫儲(chǔ)存的重要意義新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白2主要分布于基底細(xì)胞層，－20℃組，4℃組陽(yáng)性反應(yīng)明顯減弱。D/K組呈簇狀不均勻分布，空隙增大，解聚斷裂；*與新鮮皮片組相比，P<0.0190.皮膚細(xì)胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細(xì)胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫?fù)p傷的關(guān)鍵位點(diǎn)出版相關(guān)專著10余部，發(fā)表學(xué)術(shù)論著100余篇；1987年開始速凍玻璃化儲(chǔ)皮方法儲(chǔ)存的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用組別（平均積分光密度,X±SD，n=10）0190.同種異體皮主要來(lái)源于成人新鮮尸體，其次為新臨床病例Ⅲ°創(chuàng)面臨床病例術(shù)中削痂后覆蓋異體皮臨床病例術(shù)后4w異體皮排斥術(shù)后45d創(chuàng)面基本愈合皮膚低溫儲(chǔ)存的基礎(chǔ)研究進(jìn)展皮膚細(xì)胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細(xì)胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫?fù)p傷的關(guān)鍵位點(diǎn)新型抗凍劑海藻糖的發(fā)現(xiàn)，可進(jìn)一步優(yōu)化低溫抗凍液配方細(xì)胞微環(huán)境略圖黏附連接縫隙連接緊密連接橋粒各種細(xì)胞連接示意圖海藻糖分子結(jié)構(gòu)示意圖FN免疫組化染色結(jié)果

新鮮皮膚FN免疫組化染色×360-196℃儲(chǔ)存皮膚FN免疫組化染色×360-80℃儲(chǔ)存皮膚FN免疫組化染色×3604℃儲(chǔ)存皮膚FN免疫組化染色×360LN免疫組化染色結(jié)果

新鮮皮膚LN免疫組化染色×360-196℃儲(chǔ)存皮膚LN免疫組化染色×3604℃儲(chǔ)存皮膚LN免疫組化染色×360-80℃儲(chǔ)存皮膚LN免疫組化染色×360表2低溫儲(chǔ)存對(duì)皮膚表皮FN和LN含量的影響（平均積分光密度，X±SD，n=10）標(biāo)本組別FNLN新鮮皮膚144.1±43.6156.5±40.7-196℃組121.3±38.4127.8±37.3-80℃組68.9±17.9*85.9±16.4*

-20℃組31.4±8.7*54.8±9.3*

4℃組22.8±4.6*22.4±7.6**與新鮮皮片組相比，P<0.01E-cadherin免疫組化染色結(jié)果

新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染色×3604℃儲(chǔ)存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360-80℃儲(chǔ)存E-cadherin免疫組化染色×360-196℃儲(chǔ)存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360β-catenin免疫組化染色結(jié)果新鮮皮膚β-catenin免疫組化染色×360-196℃儲(chǔ)存皮膚β-catenin免疫組化染色×360

-80℃儲(chǔ)存皮膚β-catenin免疫組化染色×3604℃儲(chǔ)存皮膚β-catenin免疫組化染色×360表3低溫儲(chǔ)存對(duì)皮膚表皮E-cadherin和β-catenin含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）*

與新鮮皮片組相比，P<0.01標(biāo)本組別E-cadherinβ-catenin新鮮皮膚76.6±18.5100.2±23.9-196℃組61.8±23.487.8±17.3-80℃組23.9±11.4*65.9±18.4*-20℃組24.4±8.7*34.8±9.3*4℃組18.8±5.6*22.4±7.6*新鮮皮膚表皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，胞核圓形或橢圓形，－196℃皮膚結(jié)構(gòu)基本正常，有少量胞質(zhì)水腫，淡染，胞核縮小。(HE×400)

低溫冷凍對(duì)皮膚組織β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響新鮮組－196℃組新鮮皮膚組織β-actin主要分布于細(xì)胞質(zhì)，顏色均勻分布,陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)，－196℃組陽(yáng)性反應(yīng)減弱，但結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)染色基本呈紅色。(SP×200)

新鮮組－196℃組低溫冷凍對(duì)皮膚組織β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響透射電鏡下觀察低溫冷凍對(duì)皮膚組織微絲的影響

新鮮組較粗,束狀廣泛均勻分布。-80℃組大片束狀結(jié)構(gòu)解聚，空隙增大，見斷裂和分叉；4℃組分布不均，細(xì)絲樣物質(zhì)明顯減少，結(jié)構(gòu)松散，粗細(xì)不等。-196℃組分布較廣泛，呈束狀(×20K，電鏡）

新鮮組

-80℃

4℃

-196℃新鮮皮膚顏色均勻，陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)，T/D組近似，但有少量細(xì)胞質(zhì)水腫，胞核縮小。D/P組呈淡黃色，DMEM組呈陰性反應(yīng)。（SP×200，光鏡）

T/DD/PDMEM新鮮組海藻糖對(duì)低溫保存皮膚后β-肌動(dòng)蛋白的實(shí)驗(yàn)研究透射電鏡下觀察CPA對(duì)低溫保存皮膚后微絲的影響

新鮮組束狀廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密集分布。D/K組呈簇狀不均勻分布，空隙增大，解聚斷裂；DMEM組大部分已解聚斷裂，無(wú)明顯束狀結(jié)構(gòu)。

（×25K，電鏡）

新鮮T/DD/KDMEM皮膚β1整合素及相關(guān)蛋白免疫組化染色結(jié)果

基質(zhì)蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白關(guān)系模型laminin整合素是一類位于細(xì)胞表面黏附分子，屬跨膜糖蛋白胞外區(qū)與基質(zhì)蛋白相連，胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞骨架相連，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外雙向信息傳遞β1整合素位于皮膚基底細(xì)胞表面，維系表皮、真皮之間的連接，對(duì)維持細(xì)胞膜完整性及功能起著重要的作用整合素（Integrin）示意圖新鮮組－196℃組-20℃組4℃組低溫冷凍對(duì)皮膚組織β1整合素表達(dá)的影響新鮮正常皮膚組織β1integrin分布基底細(xì)胞細(xì)胞膜或胞漿低溫冷凍對(duì)皮膚層粘連蛋白laminin表達(dá)的影響新鮮正常皮膚組織laminin表達(dá)在真皮和表皮連接處新鮮組－196℃組－20℃組4℃組低溫冷凍對(duì)皮膚層踝蛋白talin表達(dá)的影響新鮮正常皮膚組織talin分布于基底細(xì)胞新鮮組－196℃組－20℃組4℃組低溫冷凍對(duì)皮膚α-輔肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響各溫度組皮膚組織α-actinin表達(dá)新鮮組－196℃組4℃組－80℃組低溫儲(chǔ)存對(duì)皮膚表皮β1integrin、

laminin、talin含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.05,**P<0.01標(biāo)本組別β1integrinlaminin

talin新鮮皮膚0.256±0.016

0.265±0.016

0.216±0.012

-196℃組0.245±0.0210.247±0.025

0.194±0.013*

-80℃組0.232±0.012﹡0.238±0.020﹡

0.179±0.009**

-20℃組0.165±0.015**

0.176±0.013**

0.163±0.010**4℃組0.135±0.011**

0.147±0.015**

0.152±0.017**

低溫儲(chǔ)存對(duì)皮膚組織基底膜影響新鮮組－196℃組4℃組新鮮皮膚基底膜完整、密度正常，連續(xù)性好，半橋粒結(jié)構(gòu)清晰可見，分布均勻；-196℃組中基底膜結(jié)構(gòu)基本與新鮮組相似；4℃組基底膜變薄，出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模糊不清，半橋粒明顯減少海藻糖對(duì)低溫保存皮膚β1整合素的實(shí)驗(yàn)研究T/D-7d組D/P-7d組T/D-14d組D/P-14d組14天時(shí)兩組染色程度均降低，D/P組染色強(qiáng)度降低較明顯兩種低溫保護(hù)劑對(duì)皮膚組織β1integrin表達(dá)變化影響

（平均積分光密度,X±SD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P組間比較，△P<0.05,△△P<0.01組別

7天14天新鮮組T/D組D/P組0.296±0.019

0.296±0.0190.287±0.0150.279±0.0100.284±0.0140.249±0.018**橋粒透射電鏡下觀察CPA對(duì)低溫保存皮膚基底膜的影響T/D-7d組D/P-7d組T/D-14d組D/P-14d組2周時(shí)間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，橋粒芯糖蛋白1、2免疫組化染色結(jié)果錨著在橋粒斑上的細(xì)胞骨架細(xì)絲胞質(zhì)橋粒斑蛋白細(xì)胞間空隙橋粒芯蛋白相鄰細(xì)胞膜橋粒結(jié)構(gòu)示意圖新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白1主要分布于顆粒細(xì)胞層，－20℃組，4℃組陽(yáng)性反應(yīng)明顯減弱。(SP×400)

低溫冷凍對(duì)皮膚組織橋粒芯糖蛋白1表達(dá)的影響-20℃新鮮組-196℃4℃新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白2主要分布于基底細(xì)胞層，－20℃組，4℃組陽(yáng)性反應(yīng)明顯減弱。(SP×400)

低溫冷凍對(duì)皮膚組織橋粒芯糖蛋白2表達(dá)的影響新鮮組-196℃4℃-20℃表3低溫儲(chǔ)存對(duì)皮膚表皮Dsg1和Dsg2含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）*

與新鮮皮片組相比，P<0.05標(biāo)本組別Dsg1Dsg2新鮮皮膚0.287±0.0080.254±0.007-196℃組0.283±0.0050.247±0.006-80℃組0.272±0.007*0.239±0.007*-20℃組0.235±0.018*0.164±0.008*4℃組0.203±0.012*0.115±0.021*新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、完整、數(shù)量較多-196℃組中橋粒結(jié)構(gòu)、數(shù)量基本與新鮮組相似

4℃組橋粒出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模糊不清，數(shù)量明顯減少新鮮組-196℃4℃橋粒橋粒橋粒透射電鏡下觀察低溫冷凍對(duì)皮膚組織橋粒的影響海藻糖對(duì)低溫保存皮膚橋粒芯糖蛋白1的實(shí)驗(yàn)研究D/P-21d組T/D-21d組T/D-7d組D/P-7d組表3兩種低溫保護(hù)劑對(duì)皮膚組織Dsg1表達(dá)變化影響

（平均積分光密度,X±SD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P組間比較，△P<0.05,△△P<0.01組別

7天21天新鮮組T/D組D/P組0.287±0.008

0.287±0.008

0.285±0.0060.284±0.0040.282±0.0040.275±0.005**△T/D-7d組D/P-7d組橋粒橋粒透射電鏡下觀察CPA對(duì)低溫保存皮膚橋粒的影響橋粒D/P-21d組T/D-21d組橋粒皮膚替代物的研究表皮替代物表皮細(xì)胞膜片的培養(yǎng)真皮替代物脫細(xì)胞異體真皮、人工聚合材料復(fù)合皮自體表皮+真皮替代物結(jié)語(yǔ)

深低溫皮膚儲(chǔ)存的技術(shù)為臨床救治大面積燒傷病人創(chuàng)面覆蓋工作的順利開展提供了有力的支持。但目前仍有一些不可忽視的問(wèn)題存在，如降溫速率并不十分滿意，抗凍劑的進(jìn)一步篩選；異體皮傳播肝炎病毒、HIV的可能性；異體皮來(lái)源受到極大的限制；排斥問(wèn)題的存在，排異組織溶痂及加重病情等結(jié)語(yǔ)

隨著皮膚低溫儲(chǔ)存研究的不斷發(fā)展，從而更為有效的提高異體皮活力，同時(shí)通過(guò)對(duì)皮膚替代物研究的加強(qiáng)，相信大面積燒傷患者皮源匱乏的問(wèn)題將得到進(jìn)一步解決謝謝！皮膚玻璃化儲(chǔ)存的途徑冷源問(wèn)題

目前國(guó)內(nèi)各家皮庫(kù)主要采用液氮作為冷源，溫度可達(dá)-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降溫速率可達(dá)2160℃/min皮膚玻璃化儲(chǔ)存的途徑儲(chǔ)存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來(lái)冷源溫度傳導(dǎo)困難和儲(chǔ)存不便，因此可設(shè)計(jì)成皮卷形式出版相關(guān)專著10余部，發(fā)表學(xué)術(shù)論著1