模擬失重對(duì)成骨細(xì)胞整合素亞單位表達(dá)的影響

1、模擬失重對(duì)成骨細(xì)胞整合素亞單位表達(dá)的影響 作者：楊志，王冰，李瑩輝，聶婕霖，孫喜慶，張舒 【關(guān)鍵詞】 失重；成骨細(xì)胞；整合素類 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of integrin subunits in osteoblasts during simulated weightlessness induced by clinostat. METHODS: Calvarial osteoblasts of neonate rats were cultured under conditions of normal gravity(1G)

2、and simulated weightlessness induced by clinostat respectively. The total RNA in cells was isolated in different time points (24, 48, 72 h). Reverse transcription PCR analysis was made to examine the gene expression of 5, v and 1 integrin subunits. Each value was normalized against that of actin mRN

3、A. Moreover, the protein expressions of all kinds of integrin subunits were also detected with Western blotting. RESULTS: The gene expression of 3 integrin subunits started to change from 24 h of rotation in clinostat but not in stationary cultures. The expression of integrin 5 mRNA decreased at 24,

4、 48 and 72 h of rotation by 11.3%, 18.7% and 9.8%, respectively. The same trend was saw in the expression of integrin v mRNA as 23.0%, 12.3% and 16.7%, respectively. Moreover, the expressions of integrin 2 / 151 mRNA in different periods were also declined by 15.3%, 11.4% and 26.4%, respectively. Th

5、e differences were all statistically significant as compared with controls (P<0.05). The protein expression of 3 integrin subunits also started to change from 24 h of rotation in clinostat. The expression of integrin 5 at 24, 48 and 72 h decreased by 13.1%, 20.3% and 11.9%, respectively. The

6、same trend was seen in the expression of integrin v as 7.4%, 18.2% and 25.2%, respectively. Moreover, the expressions of integrin 1 protein in different periods were also declined by 18.6%, 25.9% and 27.5%, respectively. The differences were all statistically significant as compared with controls (P

7、<0.05). CONCLUSION: The expressions of 5, v, 1 integrin subunits decrease in simulated weightlessness. 【Keywords】 weightlessness; osteoblasts; integrins 【摘要】 目的： 觀察回轉(zhuǎn)器模擬失重對(duì)成骨細(xì)胞整合素亞單位表達(dá)的影響. 方法： 培養(yǎng)的大鼠乳鼠顱骨成骨隨機(jī)分為對(duì)照組和失重組（用回轉(zhuǎn)器模擬失重條件），在實(shí)驗(yàn)的24, 48和72 h提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，檢測(cè)整合素的5, v和1亞單位mRNA表達(dá)，并計(jì)算與內(nèi)參照肌動(dòng)蛋

8、白 (betaactin) mRNA水平的比值. 同時(shí)用Western blotting檢測(cè)各種整合素亞單位的蛋白表達(dá)變化. 結(jié)果： 從模擬失重24 h開始，整合素亞單位的基因表達(dá)即發(fā)生改變，但在對(duì)照組中，基因表達(dá)無明顯變化. 整合素5 mRNA在模擬失重的24, 48和72 h分別下降了11.3%, 18.7%和9.8%；整合素v mRNA分別下降了23.0%, 12.3%和16.7%；整合素1 mRNA分別下降了15.3%, 11.4%和26.4%. 與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 整合素亞單位蛋白和基因表達(dá)的變化相似. 整合素5在模擬失重的24, 48和7

9、2 h分別下降了13.1%, 20.3%和11.9%；整合素v的蛋白表達(dá)分別下降了7.4%, 18.2%和25.2%；整合素1蛋白表達(dá)分別下降了18.6%, 25.9%和27.5%. 與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 結(jié)論： 在模擬失重環(huán)境下，整合素5, v和1亞單位mRNA的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)性變化. 【關(guān)鍵詞】失重；成骨細(xì)胞；整合素類 0引言 在失重環(huán)境下，骨骼組織發(fā)生顯著的變化：骨骼脫鈣、骨量減少及力學(xué)性能下降，嚴(yán)重影響骨骼的結(jié)構(gòu)和功能，威脅航天員返回地球后的安全1. 骨骼脫負(fù)荷引起的臨床及失重環(huán)境下的骨質(zhì)喪失已成為妨礙人類健康和太空探索能力的難題之一. 目前有

10、許多研究表明，失重和模擬失重導(dǎo)致的骨丟失是一個(gè)以骨形成抑制起主導(dǎo)作用的過程，特別是成骨細(xì)胞的增殖、分化功能以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的聚合與解聚受到了抑制，而成骨細(xì)胞的代謝紊亂，又進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的骨骼形成能力. 在航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有關(guān)成骨細(xì)胞在失重或模擬失重環(huán)境下整合素變化的研究鮮見報(bào)道. 本實(shí)驗(yàn)利用大鼠乳鼠顱骨成骨細(xì)胞，觀察模擬失重環(huán)境對(duì)細(xì)胞整合素亞單位基因表達(dá)的影響，以探討失重致骨骼結(jié)構(gòu)改變的可能細(xì)胞學(xué)機(jī)制. 1材料和方法 1.1材料達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基 (dulbeccos modified eagle medium, DMEM)由Biotech生產(chǎn)；RNA提取試劑盒（批號(hào)：D312T）,RT

11、PCR試劑盒（批號(hào)：#A1260）為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；整合素的5, v, 1亞單位和肌動(dòng)蛋白引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，PAGE法純化. 1.2方法 1.2.1成骨細(xì)胞的分離SD大鼠乳鼠4只由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量不限. 利用多段酶消化法無菌摘取大鼠乳鼠顱骨并去除骨膜. 將顱骨碎片用2.5 g/L胰蛋白酶消化90 min，去除上清液后，顱骨碎片用2.5 g/L的胰蛋白酶和1 g/L I型膠原酶混合液消化30 min，重復(fù)4次. 將消化上清液1000 r/min離心5 min，將細(xì)胞加入含100 mL/L胎牛血清(FBS), 100 U/mL青霉素及0.01 mg/

12、mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，按細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)細(xì)胞/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中. 1.2.2成骨細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞在37 50 mL/L CO2恒溫孵箱中孵育并及時(shí)進(jìn)行傳代. 經(jīng)37 50 mL/L CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)46 h后，細(xì)胞換液，每瓶灌滿含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基，密封瓶口. 再隨機(jī)分為2組（每組12瓶細(xì)胞，約3×106個(gè)細(xì)胞）：模擬失重組（利用回轉(zhuǎn)器模擬失重環(huán)境2），1 G重力組（對(duì)照組），置于相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng). 回轉(zhuǎn)器以30 r/min水平旋轉(zhuǎn). 在不同重力環(huán)境培養(yǎng)72 h后，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn). 1.2.3PCR反應(yīng)參照試劑盒說明提取總RNA

13、. 在紫外分光光度儀上測(cè)定260 nm處的吸光度，RNA的濃度（g /mL）=A260 nm×40 g/mL×稀釋倍數(shù). 計(jì)算并將各組樣本RNA調(diào)節(jié)為相同濃度，進(jìn)行RTPCR反應(yīng). 過程： 48, 45 min, 反轉(zhuǎn)錄；94, 2 min, AMV反轉(zhuǎn)錄酶失活； 94, 30 s, 變性；Tm=X,1 min，退火；68, 2 min，延伸；此過程共35個(gè)循環(huán)； 68, 7 min，延伸. Tm代表退火溫度. PCR反應(yīng)結(jié)束后將相同量DNA產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用ImageMaster TotalLab v1.11軟件(totall

14、ab凝膠成像軟件，美國(guó))測(cè)定電泳條帶的灰度值，計(jì)算整合素亞單位cDNA產(chǎn)物與內(nèi)對(duì)照肌動(dòng)蛋白cDNA產(chǎn)物的灰度比值. 從而反映整合素亞單位mRNA的表達(dá)量. 1.2.4蛋白免疫印跡樣本提取了RNA后，進(jìn)行蛋白的提取. 配制120 g/L聚丙烯酰胺凝膠，各取細(xì)胞蛋白420 g進(jìn)行SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳），電泳結(jié)束后用2.5 g/L考馬斯亮藍(lán)R250染色，觀察蛋白含量.用BioRad Mini電泳儀在冰上將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，120 V, 2.5 h. TTBS洗膜, 6次/5 min. 用50 g/L脫脂奶粉，室溫封閉1 h. 加兔抗鼠整合素5, v, 1血清(

15、1500稀釋)室溫反應(yīng)1 h后，TTBS洗膜,6次/5 min. 加HRP羊抗兔IgG(15000稀釋)室溫反應(yīng)1 h; TBS洗膜,6次/5 min.最后加入化學(xué)發(fā)光試劑，置室溫5 min后，X片顯影，定影. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 相同條件的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（n=3），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)檢測(cè)各組間差異，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)0.05. 2結(jié)果 2.1模擬失重對(duì)大鼠乳鼠顱骨成骨細(xì)胞整合素亞單位mRNA表達(dá)的影響從模擬失重24 h開始，整合素5, v, 1基因表達(dá)即發(fā)生改變，與對(duì)照組相比，5 mRNA在模擬失重的24, 48和72 h分別下降了11.3%,

16、 18.7%和9.8%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 5 mRNA的表達(dá)隨模擬失重時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的波動(dòng)變化趨勢(shì). v mRNA在模擬失重的24 h, 48 h和72 h分別下降了23.0%, 12.3%和16.7%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. v mRNA的表達(dá)隨模擬失重時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐步增加的變化趨勢(shì). 1 mRNA在模擬失重的24，48和72 h分別下降了15.3%, 11.4%和26.4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 1 mRNA的表達(dá)隨模擬失重時(shí)間的延長(zhǎng)亦呈現(xiàn)逐步增加的變化趨勢(shì)（圖1）. 2.2模擬失重對(duì)大鼠乳鼠

17、顱骨成骨細(xì)胞整合素亞單位蛋白表達(dá)的影響從模擬失重24 h開始，整合素5, v和1亞單位的蛋白即發(fā)生改變，與對(duì)照組相比，5的蛋白表達(dá)在模擬失重的24，48和72 h分別下降了13.1%, 20.3%和11.9%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. v的蛋白表達(dá)在模擬失重的24, 48和72 h分別下降了7.4%, 18.2%和25.2%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 1的蛋白表達(dá)在模擬失重的24，48和72 h分別下降了18.6%, 25.9%和27.5%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 三種蛋白表達(dá)隨模擬失重時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)逐步增加的變

18、化趨勢(shì)（圖2）. 3討論 整合素是一類重要的細(xì)胞表面受體家族，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的粘附，使細(xì)胞得以附著而形成整體. 整合素可將細(xì)胞外基質(zhì)分子（如纖粘連蛋白、膠原等）與細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白連接起來形成焦點(diǎn)粘附物，許多信號(hào)蛋白通過與焦點(diǎn)粘附物結(jié)合，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的多種功能（包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附與遷移等）3-4. 由一個(gè)亞單位和一個(gè)亞單位非共價(jià)結(jié)合構(gòu)成的異二聚體跨膜糖蛋白超家族. 至少15種亞單位和9種亞單位經(jīng)不同組合產(chǎn)生二十多種整合素，不同類型的細(xì)胞可選擇性表達(dá)某些整合素而改變其粘附特性. , 亞單位都由較長(zhǎng)的胞外區(qū)、單個(gè)跨膜區(qū)和通常較短的胞內(nèi)區(qū)三部分組成. 胞外區(qū)能與細(xì)胞外基

19、質(zhì)(ECM)大分子結(jié)合，使細(xì)胞粘附于ECM；胞內(nèi)區(qū)則與細(xì)胞骨架相互作用，將大量研究證實(shí)失重或模擬失重環(huán)境下骨骼的力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)途徑受到抑制，其中一條重要的途徑為跨膜整合素、細(xì)胞骨架和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄功能之間的直接聯(lián)系. Schneider等7將5, 1整合素的抗體加入培養(yǎng)的UMR10601成骨細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)骨的礦化率分別下降了20%和45%；加入整合素21抗體，骨的礦化率下降95%；去除抗體以后骨的礦化率又能恢復(fù)正常. Nesti等8的研究表明TGF1這種促成骨作用是通過整合素來實(shí)現(xiàn)的. 楊志明等9的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷I型膠原整合素21系統(tǒng)后，成骨細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡率增高，I型膠原，整合素2, 1及骨

20、鈣素的mRNA表達(dá)減少. 以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示整合素在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞作用. 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示失重環(huán)境下整合素發(fā)生的下調(diào)性改變可能是引起骨質(zhì)疏松的原因之一. 【參考文獻(xiàn)】 1 Holick MF. Microgravityinduced bone losswill it limit human space exploration J? The Lancet, 2000,355(9215):1569-1570. 2 Zhang S, Wu XY, Li YH, et al. Effects of simulated weightlessness on the release of PGE2 in r

21、at calvarial osteoblasts induced by flow shear stress J. Space Med Med Engin, 2001,14(4):235-239. 3 CavalcantiAdam EA, Tomakidi P, Bezler M, et al. Geometric organization of the extracellular matrix in the control of integrinmediated adhesion and cell function in osteoblasts J. Prog Orthod, 2005,6(2):232-237. 4 Brakebusch C, Fassler R. Beta