CDK4、P16在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及意義

1、CDK4、P16在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及意義【摘要】 觀察細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P16在中耳膽脂瘤上皮的表達(dá)情況，探討它們?cè)谀懼霭l(fā)病機(jī)制中的作用。方法：采用免疫組織化學(xué)技術(shù)SABC法檢測(cè)CDK4、P16在中耳膽脂瘤35例、正常外耳道皮膚20例中的表達(dá)，并結(jié)合膽脂瘤對(duì)聽小骨骨質(zhì)破壞程度，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：CDK4、P16均表達(dá)于膽脂瘤上皮的棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層，陽性率分別為68.6%、88.6%，高于對(duì)照組(前者P=0.011,后者P=0.02)。二者在膽脂瘤上皮的表達(dá)有一定的相關(guān)性，P0.05;與中耳膽脂瘤聽小骨骨質(zhì)破壞程

2、度之間無明顯相關(guān)性，P0.05。結(jié)論：CDK4與P16在中耳膽脂瘤發(fā)生中是共同而非單獨(dú)起作用的，從細(xì)胞周期的角度可反映膽脂瘤上皮細(xì)胞過度增殖的同時(shí)也增強(qiáng)負(fù)調(diào)控因子來抑制增殖，使凋亡同時(shí)加快而達(dá)到新的平衡。但與骨質(zhì)破壞程度可能無直接關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】 CDK4 P16 膽脂瘤 中耳 免疫組化 ABSTRACT Objective: To observe the expression of cyclindependent kinase4(CDK4) and cyclindependent kinase inhibitor P16 in human middle ear cholesteatoma

3、and to explore their roles in the development of cholesteatoma. Methods: Thirty2 / 18five cholesteatomas tissues and twenty normal human external ear canal skin were used in this study. All specimens were stained by an immunohistochemical SABC method to detect the expression of CDK4 and P16. Correla

4、tions between the above indexes and between the above indexes and the degree of ossicular destruction were investigated. Result: CDK4 and P16 were expressed in parabasal layers and the upper layer, mainly in the prickle and granular layers of cholesteatoma epithelium. Their positive rates were 68.6%

5、 and 88.6%, respectively. Statistical analysis showed that there was a significant difference in positive rates between the normal external ear canal epithelium and the cholesteatoma epithelium（P=0.011, P=0.02）, and a positive correlation between CDK4 and P16 in the cholesteatoma group(P0.05). The s

6、tatistical results indicated that the expression of CDK4 and P16 did not related to the extent of ossicular damage in cholesteatoma(P0.05). Conclusion： CDK4 and P16 are overexpressed in human middle ear cholesteatoma epithelium and positively correlate with each other, suggesting that they play a co

7、operative role in the development of cholesteatoma. The cholesteatoma epithelium has a hyperproliferation ability and a mechanism of inhibiting the proliferation. The result of immunohistochemical examination is not related to the degree of ossicular destruction. KEY WORDS CDK4; P16; Cholesteatoma,

8、middle ear; Immunohistochemistry 有研究表明，膽脂瘤具有過度增殖性，但它同時(shí)還存在著凋亡的增強(qiáng)1。許多細(xì)胞因子、癌基因產(chǎn)物、激素可影響細(xì)胞周期運(yùn)行，誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞增殖或凋亡，在中耳膽脂瘤發(fā)病中起作用25。p16表達(dá)產(chǎn)物P16蛋白與cyclinD競爭性特異性結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和/或CDK6而抑制其活性，對(duì)細(xì)胞增殖周期起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，即通過影響細(xì)胞周期運(yùn)行速率參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。近年來已證實(shí)CDK4與p16基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但在良性病變中的研究則較少。本研究檢測(cè)CDK4與P16在中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)，可從細(xì)胞周期調(diào)節(jié)角度為

9、探討膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防與治療提供實(shí)驗(yàn)參考。 1 資料與方法 1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本取自1999年1月至2005年2月在我科行手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的慢性膽脂瘤型中耳乳突炎35例，其中男21例，女14例，10 56歲，平均27歲；后天性33例，先天性2例。并根據(jù)手術(shù)所見參照saleh等對(duì)聽小骨破壞程度分級(jí)的建議分成4級(jí)6：未受損（O0）8例；砧骨被腐蝕、聽骨鏈中斷者（O1）5例；砧骨、鐙骨弓同時(shí)破壞者（O2）14例；錘骨柄與砧骨缺如、鐙骨弓破壞者（O3）8例。挑選其中HE染色的病理切片符合條件的石蠟包埋標(biāo)本。入選條件是鏡下具有膽脂瘤3個(gè)基本特征：基質(zhì)，即上皮組織；基質(zhì)旁組織，即上皮下結(jié)締

10、組織；囊內(nèi)容物，為角化上皮等破碎細(xì)胞成分和膽固醇結(jié)晶等物質(zhì)。對(duì)照組為正常外耳道皮膚石蠟包埋標(biāo)本20例，取自最近行鼓膜修補(bǔ)術(shù)或乳突根治術(shù)的患者。 1.2 試劑 兔抗人多克隆抗體CDK4（濃縮型，BAO310）；兔抗人多克隆抗體P16（濃縮型，BAO266）；廣譜即用型SABC試劑盒；DAB顯色試劑盒。均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。 1.3 方法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋，作3?m厚連續(xù)切片,貼于涂有0.05%多聚賴氨酸的載玻片備用。常規(guī)HE染色。鏈霉親和素-過氧化物酶法（StreptAvidinBiotin Complex,SABC）免疫組化染色按SABC試劑盒說明書進(jìn)行，

11、用購自該公司的已知陽性片作陽性對(duì)照，用PBS取代一抗作空白陰性對(duì)照。主要步驟：切片脫蠟、水化，PBS緩沖液洗3次×3?min；3%H2O2 20?10?min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次×3?min；置入0.01?M檸檬酸高溫高壓抗原修復(fù)，自然冷卻后蒸餾水洗2次×3?min，PBS洗2次×3?min；滴加抗原修復(fù)液10?min PBS洗3次×3?min；滴加正常山羊血清封閉液20?min甩去多余液體，不洗；滴加稀釋后的一抗（CDK4及P16稀釋倍數(shù)均為1200），4?過夜；PBS洗3次×3?min；滴加生物素化山羊抗兔IgG，20?2

12、0?min后PBS洗3次×3?min；滴加SABC，20?20?min PBS洗4次×5?min；DAB（3，3二氨基聯(lián)苯胺4鹽酸）室溫下顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。 1.4 結(jié)果判斷 細(xì)胞不著色，或呈淺棕色的背景顏色為陰性表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)棕黃色或褐色顆粒為陽性表達(dá)。于400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)不相重疊的著色視野進(jìn)行觀測(cè)，參照shimizu改良法7進(jìn)行結(jié)果判定及評(píng)分：（1）顯色程度：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）顯色數(shù)量：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)比例小于1/3為1分，1

13、/3 2/3為2分，2/3以上為3分。結(jié)合顯色程度及數(shù)量進(jìn)行綜合判斷，計(jì)算二者相加得分，取平均值，小于3分為（-，陰性），3分為（+，弱陽性），4分為（，中等陽性），5 分為（），6分為（），及為強(qiáng)陽性。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5版軟件包進(jìn)行分析。組間陽性率及表達(dá)強(qiáng)度的比較采用Chisquare Test，必要時(shí)用Fisher精確概率法。兩兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman Rank Corrlation 檢驗(yàn)，所有結(jié)果均以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié) 果 CDK4在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的陽性表達(dá)都位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒狀。在中耳膽脂瘤上皮中彌漫性分布于基底層以上各層

14、，靠近基底層的部分細(xì)胞表達(dá)較弱（封三彩圖1）。而對(duì)照組CDK4表達(dá)位于棘細(xì)胞層及顆粒層，顏色較淡（封三彩圖2）。兩組陽性率比較2=7.637,P=0.011（差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。結(jié)果表明CDK4在中耳膽脂瘤上皮的表達(dá)高于正常外耳道皮膚。P16蛋白陽性產(chǎn)物在膽脂瘤上皮中大部分位于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜，小部分位于細(xì)胞核，呈棕黃色細(xì)顆粒狀彌漫性均勻分布于棘細(xì)胞層、顆粒層及角化層，密度高，多在中等陽性以上（封三彩圖3、4）。而對(duì)照組P16多位于細(xì)胞漿，主要分布于角化層及部分顆粒層，密度低，多呈弱陽性（封三彩圖5）。兩組陽性率比較2=6.091, P=0.02（差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），即P16在中耳膽脂瘤的表達(dá)程

15、度明顯高于正常外耳道皮膚。CDK4、P16在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)情況，見表1。nCDK4-+陽性率在中耳膽脂瘤組P16的陽性率（88.6%）明顯高于CDK4（68.6%）,X=4.158, P0.05,但從二者的陽性片來看，24例CDK4陽性片中有22例同時(shí)表達(dá)P16，皆為陰性表達(dá)2例；35例實(shí)驗(yàn)組二者表達(dá)不一致11例。以各例的綜合判斷評(píng)分行Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，顯示二者表達(dá)強(qiáng)度呈一定程度的正相關(guān)：r=0.288, P0.05。CDK4、P16表達(dá)與聽小骨破壞程度分級(jí)之間的相關(guān)性，見表2。 3 討 論 已有研究表明，中耳膽脂瘤的發(fā)病與上皮細(xì)胞過度增殖及凋亡增多有關(guān)1。而增殖與凋亡的改變最

16、終是通過細(xì)胞周期的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。也就是說，中耳膽脂瘤的發(fā)病與其它許多疾病一樣，最終都可匯聚到細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制上來。 細(xì)胞的正常分裂、生長一方面需要細(xì)胞周期蛋白的正常分泌，需要CDKs的正性調(diào)控及許多蛋白來參與正常的活動(dòng)；另一方面，又需要另一類蛋白如P16蛋白等負(fù)性調(diào)控因子參與監(jiān)控細(xì)胞周期蛋白的過度表達(dá)。二者保持平衡是細(xì)胞維持正常生長的必要條件。因此，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的分子進(jìn)行研究將有助于理解膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖與凋亡的發(fā)生發(fā)展過程。 據(jù)報(bào)道8，9，CDK4在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、鼻咽癌等多種惡性腫瘤和細(xì)胞系中過表達(dá)，還有學(xué)者1，10，11稱與PCNA過表達(dá)部位相同。也就是說，CDK4過表達(dá)與細(xì)

17、胞的過度增殖能力相關(guān)。CDK4等多種細(xì)胞周期物質(zhì)同樣也參與膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖。Tanaka等12研究發(fā)現(xiàn)，與正常外耳道皮膚相比，CDK2、CDK4在膽脂瘤上皮中表達(dá)增加，特別是在炎癥嚴(yán)重的區(qū)域表達(dá)更高；同時(shí)檢測(cè)出IL1、KGF在炎癥區(qū)域表達(dá)增加，故而推測(cè)由于膽脂瘤上皮下的炎癥刺激導(dǎo)致炎癥細(xì)胞表達(dá)IL1等細(xì)胞因子，這些因子相互作用，上調(diào)CDK2/CDK4及其它物質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致上皮增殖。我們的研究結(jié)果顯示，CDK4在膽脂瘤中的陽性率明顯高于正常外耳道皮膚（P0.05）,而且從陽性片的表達(dá)強(qiáng)度來看，膽脂瘤以強(qiáng)陽性為主，對(duì)照組則為陽性及弱陽性（P0.05）。在膽脂瘤基底層以上陽

18、性表達(dá)更明顯，表明膽脂瘤上皮除了基底層，其它各層同樣具有從G1期進(jìn)入S期繼續(xù)分裂的能力，從而可反映膽脂瘤上皮細(xì)胞具有過度增殖的能力。然而，膽脂瘤的增殖不象惡性腫瘤一樣不受控制。已有研究提示13，膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡模式和動(dòng)力學(xué)特征與正常外耳道皮膚相似，即只是Fas蛋白（凋亡誘導(dǎo)蛋白）表達(dá)上調(diào)，凋亡的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，凋亡過程無特殊。而增殖與凋亡的量同時(shí)增加重新達(dá)到新的平衡，使死亡的細(xì)胞數(shù)增多從而產(chǎn)生更多的角化物碎屑，排出受阻最終堆積形成膽脂瘤。 本研究中P16在膽脂瘤上皮的表達(dá)陽性率88.6%，高于對(duì)照組（P0.05）,而且，陽性片表達(dá)強(qiáng)度主要在+以上，而對(duì)照組則以弱陽性為主，P0.05。另者

19、，P16在膽脂瘤的陽性部位主要見于棘層、顆粒層與角化層，與CDK4相似。統(tǒng)計(jì)學(xué)上還表明，在同一組織連續(xù)切片中，CDK4與P16的免疫組化結(jié)果中二者的陽性率、染色強(qiáng)度均存在一定程度的正相關(guān)（P0.05）。在陳謙明等14對(duì)口腔黏膜癌變過程中CDK4與P16的研究中也發(fā)現(xiàn)這一結(jié)論。由于P16作為CDK4的調(diào)節(jié)因子只是通過與其結(jié)合形成無活性或低活性的復(fù)合物，改變其構(gòu)象來抑制CyclinD與CDK4結(jié)合，并不使后者的抗原性或抗原的量發(fā)生改變，故推測(cè)在膽脂瘤形成過程中CDK4表達(dá)的改變，是先于P16的改變，而非后者的結(jié)果。因此，可能是由于位于P16下游的CDK4對(duì)前者的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)存在某種正反饋調(diào)節(jié)通路，故

20、CDK4的過表達(dá)引發(fā)了P16的代償過程。CDK4是通過什么機(jī)制來調(diào)節(jié)P16的表達(dá)呢？通過分析CDK4與P16在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用發(fā)現(xiàn)Rb與二者的作用密切相關(guān)。Shapiro等15報(bào)道了肺癌中P16、Rb表達(dá)的交互性，認(rèn)為功能性的Rb能反饋抑制P16的表達(dá)。某些病理性刺激因素引起的CDK4過表達(dá)導(dǎo)致功能性的非磷酸化Rb減少，Rb對(duì)P16的反饋抑制喪失或減弱，故P16水平相應(yīng)升高，力圖以此抑制過表達(dá)的CDK4的活性，重新恢復(fù)細(xì)胞周期的平衡。也就是說，在機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，不僅存在P16CDK4活性Rb磷酸化E2F活性受抑制細(xì)胞周期停滯于G1/S關(guān)卡的增殖抑制通路，還存在一個(gè)CDK4磷

21、酸化Rb，即非磷酸化的活性RbP16的正反饋代償回路，正是由于這種互相制約的調(diào)節(jié)體系的存在，才使得對(duì)正常細(xì)胞周期的精確調(diào)控能得以實(shí)現(xiàn)。這也從側(cè)面提示P16最終是通過影響CDK4活性而非通過改變CDK4的量來發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)機(jī)能。 從細(xì)胞周期上分析，在膽脂瘤上皮細(xì)胞中，CDK4表達(dá)上調(diào)的同時(shí)P16表達(dá)也增加，P16直接與CyclinD競爭性結(jié)合CDK4，使蛋白激酶不能活化，Rb磷酸化受阻不能釋放E2F，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，阻止上皮細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。由此可見，膽脂瘤上皮細(xì)胞盡管處于過度增殖狀態(tài)，但并非完全失控，其負(fù)調(diào)控機(jī)制同時(shí)增強(qiáng)，細(xì)胞仍具有正常凋亡的能力，這與惡性腫瘤細(xì)胞的

22、增殖有著本質(zhì)的區(qū)別（在腫瘤發(fā)展過程中，細(xì)胞不僅無限增殖而且能抵御凋亡）。且從染色體水平來看16，膽脂瘤并無明顯的染色體變異性，故無惡變傾向。而在大多數(shù)腫瘤的研究中，p16基因多發(fā)生缺失、突變或異常甲基化等改變而失活，導(dǎo)致P16蛋白表達(dá)減少，失去抑制CDK4的作用，CDK4過表達(dá)以致細(xì)胞過度增殖。這與本研究中P16在膽脂瘤上皮高表達(dá)的結(jié)果正好相反。 此外，CDK4、P16與中耳膽脂瘤聽小骨破壞程度分級(jí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示兩個(gè)指標(biāo)與分級(jí)之間均無明顯相關(guān)性（P0.05），說明CDK4、P16參與的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用只是對(duì)膽脂瘤上皮的過度增殖與凋亡起作用，該研究尚不能反映它們與膽脂瘤的骨破壞機(jī)制有關(guān)系。 總

23、之，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知CDK4及P16在中耳膽脂瘤中均過表達(dá)，且存在一定程度的正相關(guān)，說明中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞同時(shí)具有很高的增殖能力與凋亡能力。由于機(jī)體內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在正反饋通路，CDK4增高的同時(shí)負(fù)調(diào)控因子P16的表達(dá)增強(qiáng)來抑制CDK4活性，誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生，使膽脂瘤高增殖能力處于可控制狀態(tài)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Olszewska E, Chodynicki S, Chyczewski L. Evaluation of epithelial proliferation and apoptosis in cholesteatoma of adultsJ. Otolaryngol Pol, 200

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