微生物酶在發(fā)酵醬及醬油中的應用

微生物酶在發(fā)酵醬及醬油中的應用

京味素是豆發(fā)酵產(chǎn)品中最重要的食品之一。醬起源于我國,可以追溯到公元前幾千年,自古以來深受人們喜愛,素有“北方人不可一日無醬,南方人不可一日無豉”之說。早在周朝時期(約2900年前)它的制作就已經(jīng)很發(fā)達了,后來相繼傳到了越南、日本和其他國家。醬既是調(diào)味品,又可當作美味的佳肴,不但營養(yǎng)豐富,而且容易消化吸收。目前,已成為許多國家不可缺少的調(diào)味品。醬油是由豆醬衍生而來的,其生產(chǎn)工藝與豆醬相似是一類深受我國各地人民喜愛的調(diào)味料。1發(fā)酵階段的酶分解醬、醬油是以豆、麥等糧食為原料,經(jīng)過蒸煮,使原料的蛋白質(zhì)適度變性,淀粉適當糊化后制成醬醅,依靠空氣中的微生物自然發(fā)酵,在適宜的溫度下固態(tài)發(fā)酵一定時間,這時微生物在有氧的條件下極易大量生長繁殖,分泌出各種酶,有蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶等。這些酶分解原料中的多種成分,發(fā)酵前階段依靠微生物產(chǎn)酶,并利用這些酶分解大分子物質(zhì),主要變化為蛋白質(zhì)變性,可溶性蛋白和糖的溶出,為后期發(fā)酵階段酵母菌和乳酸菌提供營養(yǎng)。淀粉分解成單糖、雙糖及多糖;然后氨基酸與糖類進行美拉德反應,形成棕色色素;后酵階段,主要是通過乳酸菌及酵母菌的作用產(chǎn)生風味物質(zhì)。糖被空氣中的耐鹽型酵母菌和細菌發(fā)酵形成醇類及有機酸,并合成酯類的綜合過程,從而形成醬、醬油獨特的色、香、味、體。2發(fā)酵過程中內(nèi)源酶類的變化發(fā)酵過程中的酶按來源可分為3大類:一類是生產(chǎn)中人為添加的游離酶,即外源酶;第二類是發(fā)酵過程中各種微生物細胞中所含的酶,即內(nèi)源酶;第三類是大豆中固有的酶類。由于大豆蒸煮過程中其自身固有的酶已失活,且傳統(tǒng)釀造醬及醬油不需要人為添加發(fā)酵劑及酶,所以本文主要討論釀造過程天然微生物分泌的酶類。2.1淀粉酶2.1.1-淀粉酶的生成糖α-淀粉酶(EC3.2.1.1)亦稱淀粉1,4糊精酶,是一類能夠切開淀粉鏈內(nèi)部α-1,4糖苷鍵的酶,雖然它不能水解淀粉分支點上的α-1,6糖苷鍵以及作用于分支點附近的α-1,4鍵,但可以超越α-1,6鍵而作用于分支鏈內(nèi)部的α-1,4鍵,因此水解產(chǎn)物除麥芽糖和少量葡萄糖外,還產(chǎn)生含有α-1,6鍵的寡糖.由于生成的糖為α型,故稱α-淀粉酶。淀粉顆粒糊化后能被α-淀粉酶分解成小分子的糊精和少量糖分,使淀粉黏度降低,再進一步利用糖化酶即可使短分子的糊精全部變成麥芽糖或葡萄糖。能生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。2.1.2淀粉酶發(fā)生糖代謝糖化酶(EC3.2.1.3)亦稱淀粉α-1,4葡萄糖苷酶(Glucoamylase)簡稱糖化酶(縮寫GA或G)。這類酶作用于淀粉分子末端,它是一種外切型糖苷酶,從淀粉非還原性末端順次切開α-1,4糖苷鍵,切下一個個葡萄糖單元,生成葡萄糖。并像β-淀粉酶一樣,使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化,形成β-D-葡萄糖。它們也能作用于支鏈淀粉的α-1,6鍵,但速度較慢,將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖因此分解產(chǎn)物全部為葡萄糖,作用結(jié)果使糖的還原能力迅速增高。糖化酶也能微弱水解α-1,3連接的碳鏈,它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。此酶產(chǎn)生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、擬內(nèi)孢霉、紅曲霉。米曲霉分泌的淀粉酶主要有以上兩者,它們共同作用產(chǎn)生葡萄糖,為米曲霉、酵母菌及其他微生物提供了碳素營養(yǎng),也是酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵及谷氨酸發(fā)酵的基礎物質(zhì),還能與氨基酸化合成有色物質(zhì)。所以,淀粉的糖化程度對醬及醬油色、香、味、體均有重大影響。糖化作用完全,醬油的甜味好,體態(tài)濃厚,無鹽固形物含量高,可提高醬油質(zhì)量。2.2黑曲霉屬酶系統(tǒng)蛋白酶能夠催化蛋白質(zhì)水解的酶的總稱。各種蛋白酶共同的特點是催化分解肽鍵,使蛋白質(zhì)降解成為小分子的蛋白胨、小肽或氨基酸等物質(zhì)。Subramanian等人對醬油中蛋白質(zhì)分解酶進行了系統(tǒng)的研究和分類(如表1),該表是通過SephadexG-100(一種分離蛋白質(zhì)專用的分子篩)分離出來的蛋白酶。霉菌生產(chǎn)的蛋白酶在豆醬和醬油生產(chǎn)上的應用已經(jīng)具有相當悠久的歷史。曲霉菌,例如米曲霉、黃曲霉、棲土曲霉等,一般能分泌2～3種蛋白酶(酸性、中性及堿性),其中以中性和堿性酶為主。黑曲酶則以產(chǎn)酸性蛋白酶(最適pH2～5)為主。醬油曲霉所產(chǎn)的蛋白酶也以中性(最適pH7～8)及堿性(最適pH9～11)為主,日本的Hayashi等對其性質(zhì)做了詳細的研究。醬油曲霉蛋白酶具有典型的肽鏈內(nèi)切酶特性,一般在消化蛋白質(zhì)時切斷肽鏈的8%～15%就終止反應。在醬類釀造中,其主要作用是促使大豆蛋白溶解。若將醬油曲霉蛋白酶制成酶制劑應用到醬油生產(chǎn)上,可大大提高生產(chǎn)效率。我國無錫輕工業(yè)學院與無錫太湖醬類廠協(xié)作,曾采用米曲霉生產(chǎn)蛋白酶并應用于醬油生產(chǎn),取得了成功。醬及醬油生產(chǎn)中米曲霉主要含中性蛋白酶和堿性蛋白酶,這兩種蛋白酶主要是把原料中的蛋白質(zhì)水解為肽類,而酸性蛋白酶則是一類肽酶,可將肽類分解成氨基酸。利用黑曲霉所含的酸性蛋白酶作為發(fā)酵醬油酶系的補充,是提高氨基酸含量的一條重要途徑。黑曲酶還含有較高的谷氨酞胺酶,從而增強鮮味物質(zhì)谷氨酸的生成,對于改善醬油風味起著一定作用。醬油生產(chǎn)中大豆蛋白降解主要是由于蛋白酶的作用,為了使大豆蛋白更好地降解,從而增加醬油風味,首先要在醬油釀造中提高蛋白酶活力,其次為了使大豆蛋白從組織中充分裸露,需要破壞原料細胞壁,纖維素酶能使細胞壁內(nèi)包裹的蛋白質(zhì)和淀粉質(zhì)釋放出來,以提高原料利用率。2.3纖維二糖和纖維寡糖的糖化作用纖維素酶是指能夠水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵的酶,使纖維素變成為纖維二糖和葡萄糖,微生物產(chǎn)生的纖維素酶是幾種酶的混合物,包括Cl酶、Cx酶和β-1,4葡萄糖苷酶等,其中最重要的是C1酶和Cx酶。C1組分能將天然纖維素分解為直鏈纖維素,而Cx酶則是將直鏈纖維素內(nèi)部切斷,分解為纖維二糖和纖維寡糖,它也能將羧甲基纖維素分解為纖維二糖,β葡萄糖苷酶的作用則是將纖維二糖分解為葡萄糖。β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是指能夠水解芳香基或烷基葡萄糖甙或纖維二糖的糖苷鍵的一類酶。它可以催化水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-糖苷鍵,同時釋放β-D-糖苷鍵和相應的配基,如芳基或烴基等。在纖維素的糖化作用中,β-葡萄糖苷酶將纖維二糖和纖維素寡糖水解成葡萄糖。近年來,人們對β-葡萄糖苷酶的研究表明,它可以水解糖苷鍵而將香味氣體物質(zhì)從結(jié)合態(tài)變成游離態(tài),從而達到增香的目的,因此可作為一種風味酶。產(chǎn)生纖維素酶的微生物研究較多的是真菌,對細菌和放線菌研究很少。當前能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物主要是木菌、黑曲霉、青霉和根霉,此外漆斑霉、反芻動物瘤胃菌、嗜纖維菌、產(chǎn)黃纖維單孢菌、側(cè)孢菌、粘細菌、梭狀芽孢桿菌等也能產(chǎn)生纖維素酶,同時纖維素酶具有對植物細胞壁的溶解破壞作用,使植物細胞中的內(nèi)含物得到充分利用。2.4果膠系糖苷化果膠酶是分解果膠的酶的通稱,也是一個多酶復合物,它通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶三種酶。這三種酶的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解。天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下,被轉(zhuǎn)化成水可溶性的果膠;果膠被果膠甲酯水解酶(PE)催化去掉甲酯基,生成果膠酸;果膠酸酶切斷果膠酸中的α-1,4-糖苷鍵,生成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸進入糖代謝途徑。果膠酶對果膠質(zhì)起酯解、裂解、水解作用,產(chǎn)生半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸或不飽和的醛酸和寡聚半乳糖醛酸等物質(zhì),它們均含有一定量的醛基,具有一定的還原性。能產(chǎn)生果膠酶的菌種主要是霉菌,有文氏曲霉、蘋果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等,此外,木質(zhì)殼霉、芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、葡萄孢霉、鐮刀霉也能產(chǎn)生果膠酶。2.5乳酸和丙酮酸亞基乳酸脫氫酶(LDH,EC1.1.1.27)能催化丙酮酸生成乳酸,同時使還原型輔酶Ⅰ(NADH)氧化生成輔酶Ⅱ(NAD)。乳酸脫氫酶是一種寡聚酶,由四個亞基組成,相對分子量大約為36000道爾頓,每一個亞基具有相同的功能,具有五種同工酶,其作用是催化乳酸和丙酮酸的可逆轉(zhuǎn)化。反應中乳酸脫氫酶分子的每一個亞基都結(jié)合一個底物分子和一個輔酶分子(煙堿胺腺嘌呤二核苷酸NAD+/NADH),獨立的發(fā)生反應。該酶屬于胞內(nèi)酶,隨菌體破裂釋放到細胞外。L-乳酸脫氫酶廣泛存在于動、植物及微生物中,D-乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同于L型,卻與某些短鏈的脂肪酸脫氫酶具有同源性。在乳酸脫氫酶活力不高時,丙酮酸鹽可以通過幾個途徑重新構(gòu)建NADH,然后被代謝。這些過程給一些發(fā)酵食品帶來了特殊風味。2.6乙醇脫氫酶系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及代謝特征乙醇脫氫酶(ADH)是指催化乙醇氧化為羰基化合物(乙醛)的酶,是具有立體專一性的含鋅金屬酶,使用NAD+(煙酸胺腺嘌呤二核苷酸)作為輔酶。乙醇脫氫酶在結(jié)合非蛋白組分(輔助因子cofactor)后,才表現(xiàn)出酶的活性。ADH的輔助因子是zn2+和NAD+。在催化反應中,乙醇脫氫酶決定酶反應的專一性,而輔酶因子則直接對電子、原子起傳遞作用。乙醇脫氫酶有兩個結(jié)構(gòu)域,其中一個是催化區(qū)域,它在結(jié)構(gòu)中十分易變,另一個是結(jié)合核苷酸區(qū)域,形成多肽鏈折疊結(jié)構(gòu)。輔酶是以一種類似伸展的敞開式的構(gòu)象結(jié)合在酶上。纖維素、半纖維素水解產(chǎn)物中富含大量的糖類,包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等混合糖,其中六碳糖較容易經(jīng)微生物酵解生成乙醇。乙醇的發(fā)酵是不需要氧氣的過程,酵母菌在無氧條件下,經(jīng)EMP途徑將葡萄糖分解產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸在脫羧酶的作用下脫羧生成乙醛,乙醛在乙醇脫氫酶作用下還原生成乙醇。細菌的乙醇發(fā)酵經(jīng)過脫氧酮糖酸途徑Entner-Doudorof(ED)途徑。磷酸化的葡萄糖經(jīng)ED途徑產(chǎn)生丙酮酸,再經(jīng)丙酮酸脫羧酶脫羧生成乙醛,繼而在乙醇脫氫酶的作用下由NADH還原形成乙醇。有些細菌、酵母菌以及真菌也可代謝木糖產(chǎn)乙醇,同時還會產(chǎn)生2,3-丁二醇和各種有機酸等副產(chǎn)物。厭氧嗜熱菌能直接利用纖維素和半纖維素生產(chǎn)乙醇、乳酸和乙酸。大腸桿菌(EscheriChiacoli)也可以代謝五碳糖和六碳糖。五碳糖的代謝主要是通過磷酸戊糖途徑并與ED途徑相偶聯(lián)。六碳糖的代謝主要通過糖酵解途徑完成。其代謝產(chǎn)物包括一些醛類、醇類、和有機酸,乙醇只是其中很小部分。2.7發(fā)酵過程中的色素形成的反應酚氧化酶包括多酚氧化酶,鄰苯二酚氧化酶(EC1.10.3.1),酪氨酸酶(EC1.14.18.1),漆酶、對苯二酚氧化酶(EC1.10.3.2),還有過氧化物酶(EC1.11.1.7)。多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)是植物體內(nèi)普遍存在的一種非線粒體內(nèi)的末端氧化酶。它可以把酚類物質(zhì)如單酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、對苯二酚等氧化為相應的醌類物質(zhì),醌聚合并與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應,結(jié)果發(fā)生黑色素沉淀,進而影響食品的色澤及其品質(zhì)。多酚氧化酶和多酚類物質(zhì)接觸反應為:醬顏色的深淺是由它所含色素的多少來決定的,色素的形成主要來自三個方面:一是醬中的酪氨酸受微生物多酚氧化酶的催化,氧化聚合成的黑色素;二是醬中的糖分與氨基酸或蛋白質(zhì)經(jīng)過一種化學反應(美拉德反應)聚合成的類黑素.三是糖分經(jīng)過加熱變成的焦糖。由此可知褐變反應可分為非酶褐變及酶促褐變。非酶褐變包括氧化,焦糖化,美拉德反應。醬色50%～60%是由發(fā)酵過程產(chǎn)生的,其余由美拉德反應形成。多酚氧化酶易受一些因素的影響如Na2SO3、NaCl能抑制酶活力,因此醬醅中該酶活力較高,尤其是最初的3天內(nèi),醬醪發(fā)酵過程中,添加鹽水降低該酶的活力,而美拉德反應卻自始至終都伴隨著。在醬油的釀造過程中大豆蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物酪氨酸在氧氣充分的條件下,通過多酚氧化酶的作用,發(fā)生酶促氧化縮合反應生成黑色素。所產(chǎn)生的色澤比非酶褐變深而黑,一般在制醪后期比較明顯。該反應比較復雜,反應機理大致如下:①原料水解生成的酪氨酸在酚羥基酶作用下進行羥基化反應,形成3,4-二羥基苯丙氨酸;②3.4-二羥基苯丙氨酸在多酚氧化酶作用下生成鄰-二醌基苯丙氨酸;③鄰-二醌基苯丙氨酸經(jīng)分子重排及聚合反應形成黑色素。2.8酯酶la-co-3.1.3酯酶(EsteraseE.C.3.1.1.2)亦稱羧基酯酶,是指可以水解羧酯鍵的酶。但該酶也能催化合成低級脂肪酸酯。由于該酶既能催化酯的合成,也能催化酯的分解,因此習慣分別稱為酯化酶和酯分解酶。酵母、霉菌、細菌中均含有酯酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn),紅曲霉、根霉中許多菌株有較強的己酸乙酯合成能力。脂肪酶不同于酯酶。脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)是一類特殊的酯酶,全稱Triacylglycerolacylhydrolase。脂肪酶的正式名稱是甘油酯水解酶。它既能將脂肪水解為脂肪酸和甘油,又能催化脂肪的合成。脂肪酶是可以水解一類特殊的酯類——三羧酸甘油酯的酶,而酯酶則是可以水解羧酯鍵的。許多微生物和高等真核生物都可產(chǎn)脂肪酶,其中有細菌、真菌、酵母和放線菌,主要有假絲酵母、園酵母、黑曲霉、根霉、白腐核菌、白地霉、青霉、毛霉、鐮刀霉及假單孢菌、無色桿菌、葡萄球菌等。2.9+3豆醬原料氨基酸的形成谷氨酰胺酶(EC3.5.1.2)是控制發(fā)酵食品(如豆醬)風味的一種關(guān)鍵酶,它能分解谷氨酰胺生成谷氨酸和氨。谷氨酰胺酶是胞內(nèi)酶,只有在自溶后才能發(fā)揮作用。谷氨酰胺酶催化的反應為:C5H9O3N2+H2O→EC5H8O4N+NH3C5Η9Ο3Ν2+Η2Ο→EC5Η8Ο4Ν+ΝΗ3豆醬原料中含有的谷氨酸有46%是作為谷氨酰胺存在的,谷氨酰胺是沒有鮮味的,必需經(jīng)過谷氨酰胺酶催化水解形成谷氨酸后,才呈鮮味。谷氨酸的形成要經(jīng)過兩步發(fā)酵過程:首先是原料經(jīng)過蛋白酶和肽酶作用水解,然后是谷氨酰胺酶催化釋放出游離的谷氨酸。谷氨酰胺酶對食鹽很敏感,發(fā)酵中高濃度的食鹽會抑制該酶的活性,KazuakiYoshimune等人將MicrococcusluteusK-3進行X射線誘變,產(chǎn)生的該酶具有較高的耐鹽能力。有人研究了日本某醬油廠所使用的種曲,分離出一株曲霉菌,將它與我國醬油廠普遍使用的A3.042米曲霉按常法進行釀造對比試驗,發(fā)現(xiàn)兩者釀造出來的成品醬油氨基氮含量差不多,但前者釀出的醬油比用后者釀出的鮮味濃,經(jīng)分析前者谷氨酸含量為22.82g/L,后者僅為10.47g/L。因此,在釀造醬油時應考慮提高菌種中谷氨酰胺酶的活性或添加谷氨酰胺酶。3醬油發(fā)酵過程中的酶制劑研究取得了大成曲的發(fā)展我國醬生產(chǎn)中多數(shù)企業(yè)單一使用滬釀3042米曲霉菌種,該菌種產(chǎn)生的主要是中性蛋白酶,而淀粉酶、酸性蛋白酶;纖維素酶等活性較低,影響了原料中蛋白質(zhì)和淀粉質(zhì)的利用以及風味物質(zhì)的產(chǎn)生,因此技術(shù)力量強的企業(yè)已逐步使用多菌種發(fā)酵工藝以提高原料利用率和改善醬油風味。一些中小型企業(yè)通過添加酶制劑來使酶的配比合理化,豐富和強化醬油成曲中酶系,也是一個有效途徑。為了讓酶制劑在醬油釀造中更好地應用,釀造科技工作者做了大量研究開發(fā)應用工作,并取得很大進展。日本從1964年篩選出