植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

3.2.2.4植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備a.從-70℃保存的農(nóng)桿菌菌株EHA105甘油管中蘸取農(nóng)桿菌菌液，在無抗的YEP固體培養(yǎng)基上活化兩次。b.挑取單菌落接種于20mL無抗的YEP培養(yǎng)液中，28℃，200r/min遮光過夜振蕩培養(yǎng)。c.按2~4%的接種量轉(zhuǎn)接于無抗的50mLYEP培養(yǎng)液中，28℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)5~6h，至OD600為0.5左右。d.分裝菌液于50mL離心管中，冰浴30min.e.4℃，4,000r/min離心10min，收集菌體f.用5mL預(yù)冷的20mmol/LCaCl2重懸菌體g.4℃，4,000r/min離心10min，棄上清。用預(yù)冷的和80%的甘油混合物（4：1）重懸菌體。。2mL20mmol/LCaCl2。h.在冰浴盒中按每管100~120μL的量分裝于1.5mL離心管中。i.用液氮快速冷凍，存放于-70℃冰箱。2)凍融化轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌分別取2μL表達(dá)載體質(zhì)粒加入到裝有農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的離心管，冰浴30min，37℃水浴3~5min，再冰浴5min，加入800ul無抗YEP培養(yǎng)液，28℃振蕩培養(yǎng)4~5h。4℃，5,000r/min離心5min后，倒掉部分上清至剩余菌液約200μL，涂布于含有Kan和Rif的抗性YEP培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2d左右至單菌落出現(xiàn)。3)轉(zhuǎn)化子的PCR檢測以凍融化轉(zhuǎn)化平板上長出的單菌落為模板，用基因特異引物進行PCR菌液檢測。3.2.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PHD1基因?qū)τ衩子鷤M織的遺傳轉(zhuǎn)化3.2.2.5.1玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)選取人工授粉后11~14d、幼胚大小在1.5~2.0mm的果穗，去苞葉直至最后一層，75%的酒精表面消毒，在超凈工作臺上，用手術(shù)刀削去籽粒部分胚乳，用7d左右及時去芽去根以確保愈傷組織的正常生長。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26±1℃暗培養(yǎng)30d左右。鑷子挑出幼胚，盾片朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，3.2.2.5.2愈傷組織繼代培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)。每20d左右繼代一次，每選外觀呈現(xiàn)淡黃色、結(jié)構(gòu)緊密的愈傷組織。繼代3~4次的胚織便可用于基次繼代都挑性愈傷組因遺傳轉(zhuǎn)化。3.2.2.5.3農(nóng)桿菌侵染液的制備從-80℃冰箱中取出保到Y(jié)EP平板（含50mg/LKan和50mg/LRif）上，48h左右直至長出單菌落。挑取單菌落，接種到2mL含50mg/LKan和50mg/LRif的YEP液體培養(yǎng)基28℃、200r/min避光振蕩培養(yǎng)12h。將活化后的工程菌液按1:50～1:100的比存的含目的基因載體的工程菌菌種，接種28℃暗培養(yǎng)中，例加入到50mLYEP液體培養(yǎng)基中（含50mg/LKan和50mg/LRif），28℃、200r/min避光振蕩進行擴大培養(yǎng)。在分光光度計上測定菌液的OD600值，待工程菌長至對數(shù)生長r/min離心5min收集菌體，養(yǎng)基重懸，備用。期（OD600=0.5～0.6），將菌液轉(zhuǎn)入50mL無菌離心管中，4℃、3,000再將菌體用等體積的添加100μmol/LAS的浸染培3.2.2.5.3農(nóng)桿菌侵染玉米胚性愈傷組織將繼代培養(yǎng)7d左右，2~5mm大小的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)瓶中，加入適量制備好的農(nóng)桿菌工程菌液，浸泡10min，此間要不時地?fù)u動。浸泡完后，棄菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液。將浸染過的愈傷組織接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基22℃暗培養(yǎng)3d（以肉眼可見菌落為準(zhǔn)）。上，3.2.2.5.4胚性愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的愈傷組織置于無菌的培養(yǎng)瓶中，先用無菌水清洗3~5次，直到無菌水澄清不見菌絲為止。再用400mg/L的頭孢霉素浸泡洗滌30min，最后再用無菌水漂洗2遍，徹底洗掉附著于愈傷組織表面的無菌濾紙吸干多余水分，至恢復(fù)培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)1周左右。農(nóng)桿菌。將愈傷轉(zhuǎn)接3.2.2.5.5胚性愈傷組織的篩選培養(yǎng)將經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到除草劑篩選培養(yǎng)基上，26℃暗篩選三輪。三輪除草劑濃度依次為1、2、3mg/L[132]，每輪篩選培養(yǎng)20d。每次將明顯褐化、死亡的愈傷組織淘汰，而將生長良好、顏色淡黃、質(zhì)地酥松的胚性愈傷組織，以及在褐化愈傷組織上新長出的胚性愈傷組織繼續(xù)篩選培養(yǎng)。篩選結(jié)束后，挑選抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到恢復(fù)培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)15d左右，使抗性愈傷繁殖增生以利于后期的分化再生。3.2.2.5.6抗性愈傷組織的分化及植株再生經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到除草劑濃度為1mg/L的分化培養(yǎng)基上，28℃，2000lx，12h/d光照培養(yǎng)小苗長到1.5~2cm時，將5cm左右，長出幾條新根，抽出2~3片新葉后，防止霉菌污染，煉苗2~3d。幼苗適應(yīng)洗根凈部的培養(yǎng)基，剪掉老根和枯葉，移栽以1/2的MS培養(yǎng)基澆灌，待幼苗健壯后移栽至大田。。待分化出的其轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基上。小苗長到打開瓶蓋，加少量無菌水覆蓋培養(yǎng)基表面，室內(nèi)環(huán)境后，將其從培養(yǎng)瓶中取出，到高溫滅菌的營養(yǎng)土中，3.2.2.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PHD1基因?qū)τ衩浊o尖的遺傳轉(zhuǎn)化3.2.2.6.1玉米轉(zhuǎn)化受體的建立挑選無蟲無病的優(yōu)質(zhì)玉米種子，用70%乙醇滅菌8min，0.1%升汞滅菌7-10min，無菌水洗滌3次（第1次2倍種子體積無菌水洗1min，第2次3倍洗2~3min，第3次2倍洗1min），滅菌期間不斷搖晃種子，以保證表面滅菌徹底。然后加1.5倍種子體積無菌水，封口后放在黑暗條件下24~26℃浸泡5~6h。再用0.1%升汞滅菌8min，無菌水洗滌5次（第1次1倍種子體積無菌水洗1min，第2次2倍種子體積無菌水洗1min，第3次2~3倍種子體積無菌水洗2~3min，第4次1~2倍種子體積無菌水洗5min，第5次0.5倍種子體積無菌水洗1min），然后放入萌發(fā)盒，在黑暗條件（26~28℃）下萌發(fā)。2~3d后將萌發(fā)盒中長勢一致的幼芽轉(zhuǎn)至改良MS培養(yǎng)基中于黑暗條件（26~28℃）下繼續(xù)培養(yǎng)3~5cm時，用解剖刀將幼苗的根切至1cm左右，剝?nèi)ヅ哐壳始?~3片幼葉，出芽尖生長點，再用解剖刀從中部縱向切傷莖尖生長點。切傷莖間生長點的無菌。待胚芽長至露苗用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。3.2.2.6.2農(nóng)桿菌活化和玉米無菌苗轉(zhuǎn)化將帶有目的基因載體的工程菌在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中4℃、3000r/min離心5min，收集菌體添加100μmo/LAS的浸染培養(yǎng)基重懸。然后將菌液倒在滅菌的槍盒內(nèi)部，然后將孔（該槍盒孔的直徑為0.5cm左右，大于28℃,200r/min下振蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。在，將菌體用等體積的切好的材料一顆顆倒插入槍盒內(nèi)部的材料直徑，材料既能順利插入又能保證種子不掉下去，）使已被切傷的無菌苗莖端浸泡在菌液中，抽真空（0.05MPa）感染10min。栽至原來的培養(yǎng)基上，23℃暗培養(yǎng)幼苗移栽到上層蛭石下層土壤的花盆中，并用松散濕潤的蛭石覆蓋植株頂部，在人工氣候室避光生長浸染后的莖間用無菌濾紙吸干，將幼苗2~3d。之后取出幼苗，用溫水將培養(yǎng)基清洗干凈，然后將2~3d。然后讓植株在光照下生長，日溫22~28℃，夜溫15~21℃。隔天澆灌1/2MS培養(yǎng)基的無機鹽溶液。3.2.2.6.3轉(zhuǎn)化植株的篩選與定植待幼苗長至兩葉一心時，將其移至人工氣候室外面氣溫稍低的地方均勻噴施合適濃度的除草劑Basta水溶液進行篩選。噴施以植株葉片不掉液滴為宜。放置1h左右，待除草劑稍干之后移回人工氣候室。噴施除草劑15d左右可將幼苗移栽至大田。3.2.2.7轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測3.2.2.7.1T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測取抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA，用紫外分光光度計檢測玉米基因組OD260/OD280值，保留符合要求的DNA以備后續(xù)試驗，不符合要求的重新提取。以質(zhì)粒PCUB-ubi-Z(O)DNA-bar為陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株葉片基因組DNA為陰性對照，根據(jù)PHD1基因序列與啟動子序列結(jié)合設(shè)計跨越啟動子和目的基因的特異引物進行PCR檢測。上游：5’-CGTTCGGATGATTACCCTG-3’下游：5’-TGCTCACCCTGTTGTTTGG-3’。3.2.2.7.2T1代轉(zhuǎn)基因株系的篩選和PCR檢測將來自PCR陽性的T0代植株種子播種，幼苗期用Basta水溶液均勻噴灑植株，檢測T1代個體的除草劑抗性。除草劑噴施3d后，未轉(zhuǎn)化對照和部分T1代株系的葉尖開始發(fā)黃，一周后葉片逐漸枯黃，15d后整株死亡；部分T1代株系的葉片保持綠色或葉片發(fā)黃程度較輕（圖21），表現(xiàn)出明顯的除草劑抗性，在除草劑噴施后的半個月內(nèi)有1~2片新葉長出。取存活植株的新葉進行PCR檢測。3.2.2.7.3T1代轉(zhuǎn)基因株系的定量PCR檢測為檢測PHD1基因過量表達(dá)的效果，提取T1代株系與未轉(zhuǎn)化葉片的RNA。（方法參照。。。）凝膠電泳檢測其完整性。紫外分光光度計檢測RNAOD260/OD280檢測其純度。如果符合要求可進行下一步實驗。模板CDNA(方法參照。。。。。。)3.2.2.7.4Real-timeRCR表達(dá)驗證實驗擴增反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品均設(shè)4次重復(fù)，反應(yīng)體系及程序如下：成分用量cDNATemplate2μLPCRForwardPrimerPCRReversePrimer0.5μL0.5μLSYBR?RremixEx10μLTaqTM(2×)ROXⅡ0.4μL7μL20ulRNAFreeddH2OTOTALPCR反應(yīng)程序5:95℃30s95℃60℃72℃95℃5s34s30s1min40cycles1cycle65℃60℃到95℃繪制熔解曲線3.2.2.7.5SouthernBlot1min1cycle71cycles試劑配方：1)CTAB提取液（400ml）：CTAB，8g；1MTris-HCl，40ml；0.5MEDTA，6ml；NaCl，32.72g；亞硫酸氫鈉，2g；10﹪PVP，40ml；巰基乙醇，4ml。2)20×SSC（1L）：NaCl：175.3g檸檬酸三鈉（294.1g/mol）：88.2g，PH=7（1MHCl微調(diào)）去離子水定容至1L，高溫高壓滅菌，室溫儲存3)脫嘌呤緩沖液（0.25mol/LHCl）：21.5ml濃HCl加滅菌后的去離子水至1L，無需滅菌，室溫儲存。4)變性緩沖液（1L）：NaCl（1.5mol/L），87.66g；NaOH（0.5mol/L），20g去離子水定容至1L，高溫高壓滅菌，室溫儲存。5)中和緩沖液（1L）NaCl（1.5mol/L）：87.66g；Tris（0.5mol/L）：60.5g；PH=7.2（濃鹽酸調(diào)，約10ml）去離子水定容至1L，高溫高壓滅菌，室溫儲存6)、10％（W/V）SDS:(100ml)稱10gSDS，68℃加熱溶解PH=7.2（濃鹽酸調(diào)）滅菌去離子水定容至100ml，無需滅菌，室溫儲存7)Washingbuffer（1L）：Maleicacid（0.1M），11.6g；NaCl（0.15M），8.76g；Tween20（0.3％（V/V）），3ml；PH=7.5（NaOH約4.3g，初始PH約1.78）高溫高壓滅菌，室溫儲存8)Maleicacidbuffer（500ml）：Maleicacid（0.1M），5.8g；NaCl（0.15M），4.38gPH=7.5（NaOH調(diào)，初始PH值較低）高溫高壓滅菌，室溫儲存9)Detectionbuffer（200ml）：Tris-HCl（0.1M），2.422g；NaCl（0.1M），1.16g；PH=9.5（1MHCl微調(diào)）高溫高壓滅菌，室溫儲存操作方法1）DNA的提取（CTAB大量提取法）2）DNA的純化①每管DNA平均分成2-3管，分別補水至500μl。②加250μlTris平衡酚（取下層）和250μl氯仿/異戊醇（24:1），溫和混勻，靜止5min，12000rpm離心5min③取上清液于另一干凈1.5ml離心管中，加500μl氯仿/異戊醇（24:1），溫和混勻，靜止5min，12000rpm離心5min④在另一干凈1.5ml離心管中加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積的3MNaAc，將上清液轉(zhuǎn)移到其中，溫和混勻，-20℃沉淀30min，4℃離心，12000rpm，10min⑤70﹪乙醇洗沉淀2次，晾干后溶于200μlddHO（視DNA的量而定）23）標(biāo)記探針①用目的基因的質(zhì)粒做PCR，按試劑盒進行膠回收，要保證回收濃度盡量高，回收產(chǎn)物用以標(biāo)記探針。②取回收產(chǎn)物16μl，置沸水中煮沸10min，冰中1號溶液（1號溶液再吸取加入到上管中，混勻，最后37℃標(biāo)記20h，18-20h后根據(jù)合成核苷酸的預(yù)期產(chǎn)量開始下面的的系列稀釋，地高辛標(biāo)記的對照DNA（2號管）應(yīng)該1ng/μl。標(biāo)記的探針及對照2號溶液的2-9號管分別取1μl點在尼龍膜上（距在1cm以上），（原標(biāo)記產(chǎn)物1號仍放于37℃繼續(xù)標(biāo)記）紫外交聯(lián)驟冷5min，加入4μl試劑盒里的拿出后先混勻，瞬時離心），于③將間1200×100μJ/cm2，1min后顯影④洗膜及顯色BlockingSolution:6號溶液/Maleicacidbuffer(1:10)(試劑盒中的6號溶液可放于37℃溫浴化開)，現(xiàn)用現(xiàn)配。AntibodySolution:4號溶液/BlockingSolution（1:5000），4號溶液要10000rpm離心5min，吸取表面的液體。4℃可保存12小時。Color-substratesolution：40μlNBT/BCIPstocksolution(5號溶液，需避光)，2mlDetectionbuffer，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。下列操作均在脫色搖床上進行：Maleicacidbuffer15-25℃搖動2min；30min；10mlBlockingsolution10mlAntibodysolution30min；10mlWashingbuffer10mlDetectionbuffer2×15min；5min2mlColor-substratesolution避光顯色1-2h④終止探針反應(yīng)將標(biāo)記適當(dāng)時間的探針65℃水浴10min終止其反應(yīng)，-20℃保存?zhèn)溆谩?）酶切及酶切產(chǎn)物的回收①酶切估算DNA的量，每個樣品取50-60μgDNA，平分成兩管，每管分別用400μl的體系進行雙酶切（選用的Sac1）：內(nèi)切酶應(yīng)為該基因中沒有該酶的酶切位點，此選用酶切體系：成分用量（μl）DNA25-30μg內(nèi)切酶Sac1Buffer11040TOTAL400酶切時先加一種酶及相應(yīng)的buffer，37℃水浴5h后再補另一種酶及buffer，過夜酶切（在加第二種酶前先電泳檢測第一種酶的酶切情況，過夜酶切后再電泳檢測酶切情況，若沒有切開，應(yīng)補些內(nèi)切酶以及Buffer）②回收酶切產(chǎn)物由于電泳時點樣孔加樣量有限，所以要對酶切產(chǎn)物進行回收，目的是縮小酶切產(chǎn)物體積，以便點樣。在400μl的酶切產(chǎn)物中加2倍體積（800μl）預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積的3MNaAc，溫和混勻，-20℃沉淀30min，4℃離心，14000rpm，15min，棄上清，70％乙醇洗沉淀兩次。吹干，加40μlddH2O，溶后加5μl6×Lodingbuffer，瞬時離心。將同一樣品的兩管合為一管，待電泳（可在-20℃保存）。質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物作為正對照，質(zhì)粒可做單酶切或雙酶切，體系如下：用量（μl）成分質(zhì)粒DNA3內(nèi)切酶Sac1Buffer10.52TOTAL205）電泳試劑和儀器：0.8﹪的瓊脂糖凝膠、15kmarker；電泳儀操作過程：按下列順序點樣：marker25μl，正對照10μl+10μl6×Loding，負(fù)buffer對照（10μl6×Lodingbuffer），DNA(80μl+10μl6×Loding。0.buffer)8﹪的瓊脂糖凝膠（盡量厚些），10-20V電泳2-3cm后可逐漸加大電壓；或者15V過夜電泳亦可。6）轉(zhuǎn)膜利用毛細(xì)管作用原理向下轉(zhuǎn)膜（操作約3h），電泳結(jié)束后應(yīng)立即進行轉(zhuǎn)膜試劑和儀器：脫嘌呤緩沖液——使DNA產(chǎn)生缺口，將提高轉(zhuǎn)移的質(zhì)量變性緩沖液——使DNA由雙鏈變成單鏈，以便與探針結(jié)合中和緩沖液——與變性緩沖液中和，起到平衡作用2×SSC——用于浸濕3MM濾紙和尼龍膜；20×SSC、ddH2O托盤、吸水紙、3MM濾紙、尼龍膜、紗布、平板、盛溶液的容器、移液槍操作步驟：①切膠：將周圍無用的膠切去，切除右上角做標(biāo)記；②切好后進行洗膠：（在脫色搖床上進行）脫嘌呤緩沖液洗10-20min，至溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色（此處不應(yīng)超過20min），ddH2O洗2次變性緩沖液洗2×15min，ddH2O洗2次洗2×15min同時，將剪好的尼龍膜浸20×SSC平衡凝膠10min中和緩沖液泡于ddH2O中30min，30min后用2×SSC浸泡③壓膜：（從下往上）托盤，大的吸水紙，與膜等大的吸水紙，4層干燥的2層用2×SSC浸濕的3MM濾紙，尼龍膜（正面朝上，ddH2O浸泡30min后浸于2×SSC中），封口膜，膠（正面朝上），2層用2×SSC浸濕的3MM濾紙，鹽橋（用20×SSC潤濕的紗布，一定要拉平），用平板蓋在上面。4℃保鮮。3MM濾紙，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后若不能及時進行雜交可將膜紫外交聯(lián)后置于7）預(yù)雜交及雜交試劑和儀器：10×SSC、預(yù)雜交液（42℃預(yù)熱的7號溶液）、雜交液（7號溶液+探針）；紫外交聯(lián)儀、雜交爐操作步驟：①紫外交聯(lián)：（放在用10×SSC浸濕的3MM濾紙上（正面朝上），紫外交聯(lián)②預(yù)雜交：（是為了將膜上沒有DNA的部分封交聯(lián)后，膜用ddH2O潤洗兩遍，自然晾干后，背面緊貼管壁放于干凈的雜交管中，液（100cm2加10ml預(yù)雜交量），緩慢將膜潤濕且避免氣泡的產(chǎn)生，將兩個雜交42℃預(yù)雜交2-4h。目的是為使DNA能更牢固地結(jié)合在膜上）將膜取下目的閉）加入預(yù)熱的預(yù)雜交液，按膜的大小比例計算預(yù)雜交液的管對稱地放于雜交爐中，③雜交：將標(biāo)記好的的探針取出，煮沸5min，立即置于按照膜的大小比例（液，放于雜交爐中3.5ml/100cm2）加入預(yù)熱的雜交40h以上。（交液