主要禽病的實驗室檢測方法及結(jié)果分析

主要禽病的實驗室檢測方法及結(jié)果分析張國中（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）2011年4月23日1（一）血清學(xué)檢測方法1、免疫血清學(xué)技術(shù)抗原與抗體在體內(nèi)（外）均可發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因為抗體主要來自于血清，在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)。一、常用的實驗室檢測方法2血清學(xué)反應(yīng)的一般特點高度特異性反應(yīng)可逆性反應(yīng)二階段性影響反應(yīng)的因素3血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用抗原抗體的快速檢測微生物的鑒定與分析生物活性物質(zhì)的超微定量抗原抗體在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平定位42、血清學(xué)反應(yīng)類型及常用試驗方法反應(yīng)類型常用試驗名稱凝集試驗直接凝集試驗→平板凝集試驗（SPA）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）沉淀試驗瓊脂免疫擴(kuò)散試驗（AGP）中和試驗病毒中和試驗（VN）標(biāo)記抗體技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù)→酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）5（1）平板凝集試驗（SPA）基本原理：細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒狀抗原與相應(yīng)抗血清在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的顆粒凝集現(xiàn)象。主要應(yīng)用：雞白?。⊿P）支原體（MG/MS）6圖1平板凝集試驗檢測結(jié)果7（2）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）基本原理：某些病毒（如NDV）能夠凝集特定種類動物的紅細(xì)胞，此即紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可以被特異性抗血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗。主要應(yīng)用：新城疫（ND）禽流感（AI）產(chǎn)蛋下降綜合癥（EDS）雞傳染性支氣管炎（IB）8圖2血凝抑制試驗檢測結(jié)果G.Cattoli（OIE）9（3）瓊脂免疫擴(kuò)散試驗（AGP）基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、細(xì)菌裂解液）與相應(yīng)抗體結(jié)合,在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的沉淀物。主要應(yīng)用：雞馬立克氏病病毒（MDV）雞痘病毒（FPV）10圖3瓊脂擴(kuò)散試驗檢測結(jié)果1.抗原；2.陽性對照；3-6.待檢血清；7.陰性對照11（4）病毒中和試驗（VN）基本原理：抗原與相應(yīng)的抗血清按適當(dāng)比例混合作用后，可被中和而失去感染實驗動物、組織細(xì)胞或雞胚的能力。主要應(yīng)用：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的血清分型。12圖4采用雞胚接種進(jìn)行IBV分離空白對照病毒接種13圖5采用中和試驗對疑似IBV分離物進(jìn)行鑒定與分型空白對照病毒接種病毒+抗血清14（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）基本原理：抗原抗體反應(yīng)的特異性酶促反應(yīng)的高效性使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與某種酶連接成酶標(biāo)物，這種酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。15主要應(yīng)用：多種禽病檢測抗體檢測最常用ELISA方法：間接法，是利用酶標(biāo)記的抗抗體（一般為抗雞IgG）檢測已與固相抗原結(jié)合的抗體。16圖6間接ELISA方法測抗體的基本原理示意圖固相載體包被抗原待檢抗體酶標(biāo)二抗底物顯色17考慮血清學(xué)檢測的目的血清樣品的采集方法采集血清樣品的數(shù)量血清樣品的標(biāo)記血清樣品的貯藏及運(yùn)輸3、血清學(xué)檢測應(yīng)注意的問題181、病原分離鑒定（1）定義：指通過人工培養(yǎng)的方法分離出病原體的過程。（二）病原學(xué)檢測方法19（2）病原分離主要目的進(jìn)行疾病診斷疾病確診的黃金方法病原學(xué)研究的基礎(chǔ)20（3）病原分離方法細(xì)菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基病毒分離鑒定：雞胚、細(xì)胞或?qū)嶒瀯游锝臃N21（4）進(jìn)行病毒分離應(yīng)注意的問題樣品采集時間采集樣品種類樣品貯藏及運(yùn)輸常見接種途徑常用鑒定方法222、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（1）主要目的：通過對特異性基因片段的檢測達(dá)到檢測病原體的目的。（2）優(yōu)缺點：方便快捷、存在假陽（陰）性23圖7常規(guī)RT-PCR檢測結(jié)果（電泳圖）243、其它病原學(xué)檢測方法（1）血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗（2）瓊脂免疫擴(kuò)散試驗（AGP）（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（4）膠體金試紙條檢測（5）動物實驗檢查251、雛雞母源抗體檢查（1-3日齡）（1）了解原產(chǎn)地的免疫種類了解原產(chǎn)地易發(fā)病種類及保護(hù)性水平確定需根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r加免的疫苗根據(jù)抗體反應(yīng)追蹤是否有過感染二、實驗室監(jiān)測方案的制定26（2）了解母源抗體水平根據(jù)母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰期合理確定疫苗首免時間了解雛雞免疫保護(hù)能力，便于疫病診斷272、免疫檢查（1）免疫前檢查目的是了解免前抗體水平、決定免疫時間和進(jìn)行免疫效果評價。初免前檢查再免前檢查28（2）免疫后檢查目的是檢查免疫效果，評價免疫成功或失敗，盡快采取相應(yīng)措施確保生產(chǎn)安全。通常應(yīng)選擇免疫后14-21天進(jìn)行。29（3）定期檢查目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時采取補(bǔ)救措施，分析各種免疫之間的相關(guān)性，調(diào)整免疫程序。30（4）重要節(jié)點檢查30~50d檢查（檢查前幾次免疫效果）開產(chǎn)前檢查（產(chǎn)蛋期及雛雞保護(hù)性抗體需求）36~40W檢查（確定抗體水平、適時補(bǔ)免）313、生產(chǎn)發(fā)生變動時的檢查（1）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測做為發(fā)病時檢查的參考數(shù)據(jù)做為雞群抵抗力的依據(jù)，指示病因分析方向做為流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，利于發(fā)現(xiàn)病原變異32（2）雙份血清檢測鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗體值對比分析有很好的診斷價值。33（3）抗原檢測某些情況下，抗原檢測可以直接證實感染狀況的存在。34（4）未免疫雞群抗體檢測未免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對疾病診斷十分重要。354、重要疫病流行動態(tài)分析流行動態(tài)分析對生產(chǎn)企業(yè)來說，開展具有一定的難度，但對重要疫病，尤其是重點進(jìn)行免疫防控的疫病仍然值得重視，對長期的流行資料進(jìn)行分析，會得到極為有益的技術(shù)支持。36流行動態(tài)分析需要進(jìn)行大量工作，除抗體監(jiān)測外，必需配合針對性的實驗室研究工作，如病原分離鑒定、動物實驗和必要的分子生物學(xué)研究。371、HI檢測結(jié)果與分析（1）常見HI檢測結(jié)果1-3d15-25d25-35d35-50d>50d開產(chǎn)前36w左右≥40wH5N125-720-320-423-526-727-925-627-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-525-827-1029-1227-829-12三、重要疫病的常見檢查結(jié)果與分析38圖8種雞開產(chǎn)前NDV抗體檢測情況39（2）免疫抗體空檔期15-25d是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體尚未建立的時期野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般18-25d多發(fā)空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達(dá)到最短40圖9NDV母源抗體衰減情況41圖1015-30日齡雛雞NDV抗體檢測情況42（3）HI檢查的抗體離散度在4lg2內(nèi)是允許范圍大于4lg2的基本原因初免時母源抗體水平參差不齊免疫成功率不高-漏免太多疫苗質(zhì)量不好二免后離散度應(yīng)達(dá)到要求43（4）抗體保護(hù)臨界值通過攻毒試驗加以驗證的結(jié)果AIV要求≥26NDV要求≥28-10臨界值是針對有效保護(hù)對等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相關(guān)性。當(dāng)流行毒株變異而疫苗株保護(hù)性不足時，原有臨界值在一定程度上失去意義，需要新確立或提高臨界值水平。44（5）診斷試劑問題抗原問題：抗原不純（影響HA的確定）抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異陽性血清問題：陽性血清不純45（6）診斷指標(biāo)H5N1雙份血清檢測：應(yīng)用常規(guī)

Re-4、Re-5苗免疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則發(fā)病后10-14d可檢測出Re-4、Re-5抗體滴度上升22-3。未免相應(yīng)疫苗的情況下，檢測變異株抗體達(dá)到26-9有診斷價值。46圖11某肉種雞群發(fā)生H5感染前后抗體檢測結(jié)果（38W發(fā)生，2W產(chǎn)蛋率75%→5%，死淘20%）47圖12某肉種雞群H5感染后變異株抗體檢測結(jié)果（換羽24W發(fā)生，降蛋10%，累計死亡率5%）48H9N2產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14天，HI抗體20%以上達(dá)到212以上有診斷價值。雛雞20-30dHI抗體達(dá)到26-9有診斷價值。49ND產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14d，HI抗體≥213有診斷價值。雛雞20-35dHI抗體達(dá)到26-9有診斷價值。50圖13某肉種雞群發(fā)生NDV感染后抗體檢測結(jié)果51HI診斷應(yīng)注意的問題HI診斷應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)，當(dāng)臨床表現(xiàn)無異常而檢測結(jié)果異常時往往是檢測結(jié)果出了錯，應(yīng)提高警惕。522、平板凝集試驗（SPA）檢測結(jié)果與分析（1）可用于MG、MS、SP檢查（2）可進(jìn)行血清平板和全血平板，相對來說血清平板更準(zhǔn)確和易于判斷。53（3）SPA準(zhǔn)確率相對較差，假陽性率高，一般群體檢查超過30%以上陽性才有確實群體感染的診斷意義。（4）國內(nèi)產(chǎn)品和國外產(chǎn)品特異性上有一定差距。543、瓊脂擴(kuò)散試驗（AGP）檢測結(jié)果與分析（1）可用于MD、POX和IC（2）對MD可進(jìn)行抗體、抗原兩種檢測50d左右，50%以上抗體陽性預(yù)示疫苗反應(yīng)正常用羽髓做瓊擴(kuò)有發(fā)病診斷價值55（3）POX常不用檢測，通過觀察接種部位反應(yīng)可了解免疫效果，觀察臨床癥狀進(jìn)行疫病診斷。（4）IC的瓊擴(kuò)試劑很少，可從國外進(jìn)口或選用日本北里所的間接血凝試劑。564、ELISA檢測結(jié)果與分析（1）目前可應(yīng)用ELISA檢測的疾病ND、AIMG、MS、SPIB、IBD、REO、AE、RE、ILT、CIAALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag57（2）常見ELISA檢測結(jié)果1-3d15-25d25-35d>50d開產(chǎn)前產(chǎn)蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004000-100004000-100004000-12000REO2000-50000-5000-20002000-60002000-150002000-15000ILT2000-30000-10000-5002000-40002000-60002000-6000AE500-20000-5000-300300-6000300-8000500-8000CIA+（<0.3）+/--+/-+（<0.1）+（<0.1）58（3）ELISA試劑盒之間的差異每種試劑盒都有自己的特定的陽性值及敏感范圍。原則上同一疾病不同廠家ELISA試劑盒之間沒有直接可比性，除非做過平行對比研究。同一病