液相色譜基本理論培訓(xùn)課件

液相色譜基本理論質(zhì)量管理部液相組2011.08.03色譜分析方法的發(fā)展歷史：1906年，俄國(guó)植物化學(xué)家Tswett首次提出色譜20世紀(jì)30年代后，出現(xiàn)了紙色譜離子交換色譜和薄層色譜1952年，英國(guó)Martin和Synge研究了氣—液分配色譜1958年，Moore和stein研究了液相離子交換色譜，氨基酸色譜分析儀器出現(xiàn)20世紀(jì)60年代中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，液相色譜開始活躍20世紀(jì)70年代微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，提高了自動(dòng)化水平。20世紀(jì)90后，生物工程和生命科學(xué)的發(fā)展，為HPLC提出更多課題。21世紀(jì)后，生物大分子和手性化合物的分離和分析對(duì)HPLC提出更高要求。色譜分析方法的特點(diǎn):特點(diǎn):HPLC的特點(diǎn)可以歸結(jié)為“三高一廣一快”。即高壓，高效，高靈敏度;使用范圍廣；分析速度快。優(yōu)點(diǎn)：可以用于高沸點(diǎn)，分子量大，難揮發(fā)的有機(jī)物質(zhì)和有生物活性物質(zhì)的分析和分離，分析速度快，靈敏度高，選擇性好缺點(diǎn)：缺少通用型的檢測(cè)器類型，不能用于有機(jī)物質(zhì)的準(zhǔn)確定性色譜分析方法的兩個(gè)理論依據(jù)：塔板理論（platetheory）理論假設(shè)：快速分配平衡；脈動(dòng)式的進(jìn)入；沿柱方向擴(kuò)散；分配系數(shù)為一定值。解決的問(wèn)題：色譜流出曲線方程：C=[C0/δ(2π)0.5]e-(t1-t2)/2δ可以導(dǎo)出n與色譜峰半峰寬度或峰底寬度的關(guān)系：n=5.54(tR/W1/2)2

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16(tR/W)2優(yōu)點(diǎn)：成功的解釋了流出曲線的形狀（呈正態(tài)分布），濃度極大點(diǎn)的位置以及計(jì)算評(píng)價(jià)柱效能的方法。缺點(diǎn)：不能解釋塔板高度是受那些因素影響的本質(zhì)問(wèn)題不能解釋為什么在不同的流速下可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)速率理論（ratetheory）理論假設(shè)：由踏板理論和塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素構(gòu)成。H=A+B/u+cU①渦流擴(kuò)散項(xiàng)（多路徑效應(yīng)）：A=2λdpλ----填充物的不均勻性dp------填充物的平均顆粒直徑實(shí)際意義：使A↓可使H↓→n=L/H→n↑塔板數(shù)上升可以提高柱效②分子擴(kuò)散項(xiàng)（縱向擴(kuò)散項(xiàng)）：B=2rDgr----因載體填充在柱內(nèi)而引起的氣體擴(kuò)散路徑彎曲的因數(shù)Dg----組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)反比于再起相對(duì)分子量的平方根實(shí)際意義：M↑→Dg↓→(B/U)↓→n↑塔板數(shù)上升可以提高柱效③傳質(zhì)阻力項(xiàng)：C=Cg+ClCg----氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cl----液相傳質(zhì)阻力項(xiàng)關(guān)于基線的3個(gè)概念基線：沒有組分進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，反映檢測(cè)器系統(tǒng)噪聲隨時(shí)間變化的線稱為基線基線漂移：基線隨時(shí)間的定向緩慢變化基線噪聲:指由各種因素所引起的基線起伏兩個(gè)重要因子選擇因子α：某組分2的調(diào)整保留時(shí)間與另一個(gè)組分1的調(diào)整保留時(shí)間的比值α=r21=t’(2)/t’(1)容量因子κ：在一定的溫度和壓力下，在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在兩相間的質(zhì)量比κ=ms/mm一個(gè)系數(shù)分配系數(shù)K：在一定的溫度下，在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在兩相間的濃度比K=Cs/Cm幾個(gè)重要色譜數(shù)學(xué)表達(dá)式：分離度：R=[tR(2)-tR(1)]/0.5(Y1+Y2)色譜分離基本方程式:R=1/4n1/2[(a-1)/a][k/(1+k)]理論塔板數(shù)與板高度方程式:n=5.54(tR/Y1/2)2

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16(tR/Y)2H=L/nHPLC色譜條件的優(yōu)化：1.流動(dòng)相的優(yōu)化：HPLC要提高分離的效率，必須提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性和減小填充物質(zhì)的顆粒粒徑，以加快傳質(zhì)效率。選用低粘度的流動(dòng)相，也可以在一定程度上提高傳質(zhì)效率。2.柱溫的選擇:溫度恒定可以使流動(dòng)相的粘度相對(duì)穩(wěn)定，以保持保留時(shí)間穩(wěn)定的重現(xiàn)性，適當(dāng)提高柱溫以降低流動(dòng)相的粘度，可以在一定程度上提高傳質(zhì)效率。3.進(jìn)樣時(shí)間和進(jìn)樣量的選擇：進(jìn)樣時(shí)間太長(zhǎng)，試樣原始濃度變大，半峰寬變寬，柱效下降，故進(jìn)樣速度必須快；進(jìn)樣量太多，峰疊加，分離不好，進(jìn)樣量少又會(huì)使含量少的組分檢測(cè)不到，應(yīng)控制在峰高和峰面積與進(jìn)樣量呈線性關(guān)系的范圍內(nèi)。4.分離模式的選擇：合成高分子一般用體積排阻色譜（SEC）;蛋白質(zhì)一般用凝膠過(guò)濾色譜（GFC）和體積排阻色譜（SEC）;小分子可以根據(jù)其溶解性對(duì)其選擇，水溶性的強(qiáng)極性物質(zhì)反相色譜（RPC）為其首選分離模式;醇溶性的物質(zhì)可以選用正相色譜（NPC）為其首選分離模式。具體色譜條件分析：格列奇特分離度調(diào)整：T=35F=1M=水：乙腈=60:40→R=1.22T=35F=0.8M=水：乙腈=60:40→R=1.31T=25F=0.8M=水：乙腈=60:40→R=1.37T=25F=0.8M=水：乙腈=60:40→R=1.51T=25F=0.8M=水：乙腈=50:50→R=0.63T=25F=1.0M=水：乙腈=65:35→R=2.55T=25F=1.5M=水：乙腈=65:35→R=2.40峰保留值調(diào)至正常主要參考文獻(xiàn)：⑴朱明華.儀器分析.北京：高等教育出版社，199