高三生物二輪復(fù)習(xí)講義非選擇題專項(xiàng)突破5：借用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路破解生物工程題目

高三生物二輪復(fù)習(xí)非選擇題專項(xiàng)突破借用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路破解生物工程題目【真題剖析】(2022·山東等級(jí)考)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā),蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解,藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理,需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一種短肽,連接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合,但不影響P或PΔ的功能。(1)為構(gòu)建重組載體,需先設(shè)計(jì)引物,通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是,

為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割,需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列,該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的(填“3'端”或“5'端”)。

(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后,與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因,如圖甲所示,其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后,融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確,翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確,但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析,出現(xiàn)該問題的原因是

。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題,具體修改方案是

。(3)融合蛋白表達(dá)成功后,將FLAG-P、FLAG-PΔ、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì),分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③組結(jié)果的差異推測(cè),藥物A的作用是;由②④組或③⑤組的差異推測(cè),PΔ中缺失的特定序列的作用是。

(4)根據(jù)以上結(jié)果推測(cè),藥物A治療該病的機(jī)理是。

[答題模板]以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路,梳理題目信息項(xiàng)目?jī)?nèi)容目的利用基因工程探索藥物A治療由蛋白P引發(fā)的白血病的機(jī)理原理①將P基因或P△基因插入含編碼FLAG的序列的載體中,獲得含融合基因重組載體,將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后使其正確表達(dá),即可獲得融合蛋白。②利用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè),若樣品中含有FLAG,它們就會(huì)被含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)滯留;用抗UBC的抗體檢測(cè)介質(zhì)中的UBC含量,若出現(xiàn)UBC的條帶,說明FLAG-P或FLAG-P△能與UBC結(jié)合操作步驟(1)設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增P基因。設(shè)計(jì)的引物需能與P基因模板鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)(2)將P基因插入載體,與編碼FLAG的序列形成融合基因。為了使P基因能與載體連接,需在引物的5'端添加限制酶識(shí)別的序列(3)將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞并使其表達(dá)融合蛋白。由圖甲可知,由于EcoRⅠ識(shí)別序列的添加,P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸,導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取。因此可在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3'端添加1個(gè)堿基解決此問題(4)將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照不同組合分成圖乙所示①~⑤五組,分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì),分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè),以此確定P是否能結(jié)合UBC,以及藥物A對(duì)P與UBC結(jié)合的影響檢測(cè)結(jié)果分析按照單一變量原則對(duì)圖丙結(jié)果進(jìn)行分析:①和②單一變量是有無FLAG,兩組對(duì)比可知UBC能與P結(jié)合并通過FLAG滯留在介質(zhì)處;②和③單一變量是有無藥物A,兩組對(duì)比可知藥物A能促進(jìn)UBC與P的結(jié)合;②和④或③和⑤的單一變量為是否缺失P中特定氨基酸序列,通過對(duì)比可知P中特定氨基酸序列參與P與UBC的結(jié)合結(jié)論藥物A通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合促進(jìn)P降解模板構(gòu)建1.題目特點(diǎn):此類試題往往為“任務(wù)驅(qū)動(dòng)型”,圍繞實(shí)現(xiàn)某一任務(wù)或?qū)嶒?yàn)?zāi)康倪^程中使用的工程技術(shù)、原理、以及最終結(jié)果分析和應(yīng)用設(shè)置一系列問題。2.答題模板:此類試題中涉及的工程技術(shù)和原理一般為達(dá)成最終的目的服務(wù),因此可借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路,梳理并理解題目中涉及的工程技術(shù)流程,并結(jié)合題目相關(guān)信息和工程技術(shù)原理進(jìn)行分析作答。3.關(guān)鍵點(diǎn):明確題目中為答成任務(wù)目標(biāo)而涉及的工程技術(shù)、原理以及實(shí)驗(yàn)分析方法答案:(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸5'端(2)P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸,導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3'端添加1個(gè)堿基(3)增強(qiáng)FLAG-P與UBC的結(jié)合參與P與UBC的結(jié)合(4)通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合促進(jìn)P降解[評(píng)分細(xì)則]規(guī)范答題不失分評(píng)分細(xì)則答題規(guī)則(1)4分。第一空2分,能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。只答出“短單鏈核酸”得1分;第二空2分,5'端。(2)4分。第一空2分,P基因編碼的第一個(gè)堿基(或A)與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基(或TC)編碼一個(gè)氨基酸,導(dǎo)致的RNA的密碼子被錯(cuò)位讀取(其他相同含義的描述也可);第二空2分,在引物的EcoRⅠ識(shí)別序列3'端添加1個(gè)堿基。(3)2分。第一空1分,增強(qiáng)(或加強(qiáng)、促進(jìn))FLAG-P(或P)與UBC結(jié)合;第二空1分,參與P與UBC的結(jié)合(作用)或P與UBC的結(jié)合(作用)位點(diǎn)。(4)2分。藥物A通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合(作用)促進(jìn)P降解,或答成藥物A能促進(jìn)藥物P降解。其他答案不得分規(guī)則1.盡量使用課本中的語句作答。規(guī)則2.生物學(xué)名詞要書寫正確。規(guī)則3.答題要完整、全面。規(guī)則4.理由的得出應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并且答題符合邏輯【典例訓(xùn)練】1.某地中海貧血(TDT)是單基因病,嚴(yán)重時(shí)可能危及生命。人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后,γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列,解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制,可對(duì)TDT患者進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段,將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè),以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。(1)圖中啟動(dòng)子是識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn),且啟動(dòng)子是具有方向性的,目的基因只有正確插入啟動(dòng)子和終止子之間才能正確表達(dá)。在表達(dá)載體中綠色熒光蛋白基因作為,要使綠色熒光蛋白基因表達(dá)出來,圖b中還缺啟動(dòng)子,請(qǐng)判斷即將插入的啟動(dòng)子方向(填“向左”或“向右”)。

(2)PCR擴(kuò)增γ基因上游不同DNA片段的原理是,為使PCR反應(yīng)體系中的模板解鏈為單鏈,需要滿足的條件是。

(3)將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達(dá),需要在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知,在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶應(yīng)為,在F1~F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是。

(4)從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程中,除限制酶外,還必須用到的工具酶有DNA連接酶和,其中前者催化形成的化學(xué)鍵是。

(5)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白,受體細(xì)胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是。

(6)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列,據(jù)此結(jié)果可推測(cè),BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于

。

【解析】(1)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn),用于基因的轉(zhuǎn)錄。綠色熒光蛋白基因作為表達(dá)載體中的標(biāo)記基因。要使綠色熒光蛋白基因表達(dá)出來,圖b中還缺啟動(dòng)子,即將插入的啟動(dòng)子方向向左。(2)PCR擴(kuò)增的原理是DNA雙鏈復(fù)制。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí),利用DNA的高溫變性加熱至90~95℃,破壞雙鏈之間的氫鍵,使DNA解鏈變?yōu)閱捂湣?3)據(jù)圖中對(duì)限制酶的注釋可知,限制酶MunⅠ識(shí)別切割后的黏性末端與限制酶EcoRⅠ識(shí)別切割后的黏性末端相同,故R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是EcoRⅠ。在F1~F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是SalⅠ。(4)從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程中,除限制酶外,還必須用到的工具酶有DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶,DNA連接酶作用的對(duì)象是磷酸二酯鍵。(5)只有擴(kuò)增產(chǎn)物中含有完整的啟動(dòng)子,熒光蛋白基因才能表達(dá),含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子,熒光蛋白基因不表達(dá)。(6)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,此時(shí)重組載體上的BCL11A基因表達(dá),產(chǎn)生BCL11A蛋白,BCL11A蛋白與BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后,導(dǎo)致熒光蛋白基因被抑制;含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光,則說明BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)在引物F4與引物R之間的序列上,含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光,則說明BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)在引物F5的上游序列,故據(jù)此結(jié)果可推測(cè),BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上。答案:(1)RNA聚合酶標(biāo)記基因向左(2)DNA雙鏈復(fù)制加熱至90~95℃(3)EcoRⅠSalⅠ(4)耐高溫的DNA聚合酶磷酸二酯鍵(5)F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子,熒光蛋白基因不表達(dá)(6)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上2.金黃色葡萄球菌是食源性致病菌,隨著抗生素的大量使用,金黃色葡萄球菌的耐藥性越來越強(qiáng),給臨床治療帶來了極大的困難。已知金黃色葡萄球菌的耐鹽性高,并能夠利用甘露糖醇產(chǎn)酸,從而使溴麝香草酚藍(lán)溶液變黃。某興趣小組對(duì)生鮮肉中金黃色葡萄球菌進(jìn)行了分離、鑒定,過程如圖所示。(1)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一般都含有等。高鹽平板2能夠鑒定金黃色葡萄球菌,則該平板與高鹽平板1相比,還需添加,

并選取使培養(yǎng)基呈色的菌株進(jìn)行保存或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

(2)高鹽平板2的接種方法是,用此方法計(jì)數(shù)時(shí),所得的菌落數(shù)比活菌數(shù)目偏少,原因是。

(3)抑菌圈是指利用待測(cè)藥物在瓊脂平板中的擴(kuò)散,使其周圍的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制而形成的透明圈。為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的抗藥性,將浸有不同抗生素且大小相同的紙片分別貼附在涂有金黃色葡萄球菌的平板上,培養(yǎng)一段時(shí)間后,結(jié)果如圖所示。由圖可知,該菌對(duì)抗生素(填序號(hào))的抗性最強(qiáng)。如果隔一段時(shí)間后在抑菌圈中又長(zhǎng)出少許菌落,分析其原因可能有(至少寫出兩種)。

【解析】(1)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一般都含有水、無機(jī)鹽、氮源、碳源。結(jié)合題意“金黃色葡萄球菌的耐鹽性高,并能夠利用甘露糖醇產(chǎn)酸,從而使溴麝香草酚藍(lán)溶液變黃”可知,高鹽平板2能夠鑒定金黃色葡萄球菌,該平板屬于鑒定培養(yǎng)基,故應(yīng)添加甘露糖醇和溴麝香草酚藍(lán)溶液;在該培養(yǎng)基上金黃色葡萄糖球菌可以利用甘露糖醇產(chǎn)酸從而使溴麝香草酚藍(lán)溶液變黃,故應(yīng)選取黃色的菌株進(jìn)行保存或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。(2)據(jù)圖可知,高鹽平板2上的菌落均勻分布,該接種方法是稀釋涂布平板法;稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí),當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落,故用此方法計(jì)數(shù)時(shí),所得的菌落數(shù)比活菌數(shù)目偏少。(3)據(jù)圖可知,接種頭孢唑林的培養(yǎng)基中的抑菌圈最大,即表明頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng),而④氧氟沙星的抑菌圈最小,說明該菌對(duì)其抗性最強(qiáng)。如果隔一段時(shí)間后在抑菌圈中又長(zhǎng)出少許菌落,原因可能是該菌產(chǎn)生了抗性突變;落入了雜菌;抗生素失效。答案:(1)水、無機(jī)鹽、氮源、碳源甘露糖醇和溴麝香草酚藍(lán)溶液黃(2)稀釋涂布平板法當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落(3)④該菌產(chǎn)生了抗性突變;落入了雜菌;抗生素失效3.研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列,它可以位于基因的上游,也可以位于基因的下游。人肺特異性X蛋白基因(LUNX基因)僅在上顎、鼻咽和氣管等呼吸道部位表達(dá),可作為非小細(xì)胞肺癌診斷的標(biāo)志物。為了研究LUNX基因的增強(qiáng)子是否具有促進(jìn)基因表達(dá)的功能,以及其發(fā)揮作用的位置是位于基因的上游還是下游,科研人員首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了LUNX基因的3個(gè)增強(qiáng)子片段(E1~E3),然后分別連接到pGL3質(zhì)粒中熒光素酶報(bào)告基因(Luc+)的上游或下游,最后通過檢測(cè)熒光素酶的活性進(jìn)行判斷。(1)通過PCR擴(kuò)增LUNX基因的增強(qiáng)子片段時(shí),需要在反應(yīng)體系中添加引物的原因是。擴(kuò)增E1片段時(shí),需選用圖1中的引物,為了將E1片段與pGL3質(zhì)粒相連,應(yīng)在引物的端添加限制酶切割位點(diǎn)。

(2)構(gòu)建含LUNX基因增強(qiáng)子的重組載體時(shí),需要對(duì)通過(1)獲得的PCR產(chǎn)物和圖2中的pGL3質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切,這樣做的目的是,最終構(gòu)建出種重組載體。

(3)已知熒光素酶報(bào)告基因(Luc+)的表達(dá)強(qiáng)度越高,熒光素酶的活性越高,該實(shí)驗(yàn)中各組熒光素酶活性的檢測(cè)結(jié)果如圖所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè),在E1~E3中促進(jìn)基因表達(dá)的功能最強(qiáng)。E1~E3發(fā)揮作用的位置不同之處在于

。

【解析】(1)通過PCR擴(kuò)增LUNX基因的增強(qiáng)子片段時(shí),需要在反應(yīng)體系中添加引物的原因是耐高溫的DNA聚合酶不能從頭開始合成子鏈,只能從引物的3'開始子鏈的延伸。擴(kuò)增E1片段時(shí),結(jié)合子鏈延伸的方向以及目的基因的位置可確定需選用圖1中的引物2和3,為了將E1片段與pGL3質(zhì)粒相連,應(yīng)在引物的5'端添加限制酶切割位點(diǎn),從而為目的基因的切割做準(zhǔn)備。(2)構(gòu)建含LUNX基因增強(qiáng)子的重組載體時(shí),需要對(duì)通過(1)獲得的PCR產(chǎn)物和圖2中的pGL3質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切,這樣可以將E1~E3定向連接到Luc+的上游或下游,避免自連和反向連接,最終根據(jù)目的基因的種類和連接部位構(gòu)建出6種重組載體。(3)題圖中顯示E1增強(qiáng)子位于下游時(shí),熒光素酶活性最高,說明此時(shí)熒光素酶的表達(dá)量最大,因此可以推測(cè),在E1~E3中,E1促進(jìn)基因表達(dá)的功能最強(qiáng),且在下游效果最好。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)可以看出,E1~E3發(fā)揮作用的位置不同之處在于E1和E2只在基因的下游時(shí)增強(qiáng)基因的表達(dá),E3在基因的上游和下游時(shí)都能增強(qiáng)基因的表達(dá)。答案:(1)耐高溫的DNA聚合酶不能從頭開始合成子鏈2和35'(2)將E1~E3定向連接到Luc+的上游或下游6(3)E1E1和E2只在基因的下游時(shí)增強(qiáng)基因的表達(dá),E3在基因的上游和下游時(shí)都能增強(qiáng)基因的表達(dá)4.β-1,3葡聚糖酶可以水解許多病原真菌細(xì)胞壁外層的β-1,3葡聚糖和幾丁質(zhì),降解真菌細(xì)胞壁,從而抑制真菌的生長(zhǎng)與繁殖。研究人員在植物中克隆到β-1,3葡聚糖酶基因(BG2)并轉(zhuǎn)入蘋果主栽品種,以減少蘋果真菌病害、實(shí)現(xiàn)無公害生產(chǎn)。回答下列問題:(1)BG2的克隆可利用PCR技術(shù),該過程需要一對(duì)特異性引物,引物是指

。

在體外對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制后,常采用來鑒定產(chǎn)物。

(2)如圖為利用PATC940(由農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒改造獲得)構(gòu)建BG2抗病質(zhì)粒的過程。圖中右下處的酶為,人工設(shè)計(jì)的復(fù)合啟動(dòng)子的作用是。XbaⅠ酶切后片段與SpeⅠ酶切后的片段能進(jìn)行連接的原因是。

(3)構(gòu)建BG2抗病質(zhì)粒完成后,首先將BG2重組抗病質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌,該過程中需要用CaCl2處理農(nóng)桿菌,目的是。研究人員將轉(zhuǎn)入BG2抗病質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與蘋果外植體共培養(yǎng),以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。目的基因BG2將隨著T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞而進(jìn)入細(xì)胞,并隨其整合到上。

(4)在完成遺傳轉(zhuǎn)化后,需要不斷觀察和檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蘋果植株在田間的生長(zhǎng)狀態(tài),以確定目的基因是否賦予了蘋果植株?！窘馕觥?/p>