其它有機(jī)酸發(fā)酵工藝蘋果酸

其它有機(jī)酸發(fā)酵工藝蘋果酸第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日概述

L-蘋果酸(L-malicacid簡稱L-Ma)是生物體糖代謝過程中產(chǎn)生的重要有機(jī)酸，廣泛存在于生物體中、在未成熟的蘋果、葡萄、櫻桃等的水果和蔬菜中含量約為0.4%。蘋果酸發(fā)酵研究歷史。我國在發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸方面的研究工作。蘋果酸發(fā)酵生產(chǎn)的現(xiàn)狀。第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸發(fā)酵研究歷史早在20世紀(jì)20代Kostychev等利用蔗糖發(fā)酵時，在加CaCO3的培養(yǎng)基中就獲得了L-蘋果酸。1959年阿部重雄等普查了260株曲霉、120株青霉和80株根霉的產(chǎn)蘋果酸能力，選出了黃曲霉A-114菌株，并對此菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的探索。搖瓶發(fā)酵7～9d、產(chǎn)蘋果酸最高濃度可達(dá)50g/L。第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日1976年米光英一，利用出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans）可直接由糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸。例如由葡萄糖50g、NaNO32.0g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O0.05g、酵母膏0.05g，水1.0L配成培養(yǎng)基、滅菌冷卻后，接種出芽短梗霉，同時加CaCO32%，27℃振蕩培養(yǎng)5d，1.0L培養(yǎng)基中含L-蘋果酸25.2g。第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日酶催化法生產(chǎn)蘋果酸日本田道制藥公司首創(chuàng)以精制富馬酸為原料，通過產(chǎn)氯桿菌菌體固定化，將富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。1972年，千火田一郎等，以產(chǎn)氨短桿菌為生產(chǎn)菌株，以聚丙烯酰胺凝膠為載體進(jìn)行菌體固定化連續(xù)生產(chǎn)L-蘋果酸。但利用此菌種進(jìn)行反應(yīng)過程中，副產(chǎn)物琥珀酸很難與L-蘋果酸分開,經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，用含脫氧膽酸或膽酸的基質(zhì)溶液進(jìn)行處理，可抑制副產(chǎn)物琥珀酸的生成。提高了L-蘋果酸的產(chǎn)量。在工業(yè)生產(chǎn)上選擇了最廉價的膽汁為膽酸。抑制副產(chǎn)物琥珀酸的生成。1974年田邊制藥公司以此法進(jìn)行L-蘋果酸連續(xù)生產(chǎn)。在容積1000L的充填塔中，日夜連續(xù)反應(yīng)，日產(chǎn)L-蘋果酸15.4噸。

第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日1987年Chikata、Ichiro等建立了一個1000L的以K-卡拉膠固定黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)的固定化反應(yīng)柱，持續(xù)6個月，每小時能生產(chǎn)42.2Kg/L蘋果酸。1990年Fialovo、Marie等建立了一個中試車間，用藻朊酸固定棒桿菌細(xì)胞、流加富馬酸鹽溶液，每90d生產(chǎn)20噸蘋果酸。田道制藥公司和三菱化成公司用此工藝大量生產(chǎn)L-蘋果酸。產(chǎn)品主要用于醫(yī)藥工業(yè)的大輸液、pH調(diào)節(jié)劑和某些藥物的中間體。第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日我國在發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸方面的研究工作中國科學(xué)院北京微生物研究所研究了固定化皺褶假絲酵母(Candidarugosa)的蘋果酸生產(chǎn)技術(shù)。福建省三明真菌研究所研究了L-蘋果酸的霉菌固體發(fā)酵。1981年起無錫輕工大學(xué)金其榮等，普查了261株各種曲霉的蘋果酸生產(chǎn)能力，并對菌種進(jìn)行了誘變處理和發(fā)酵最佳條件的探討，選出了優(yōu)良菌株黃曲霉(Aspergillusflavus)UVT3，并在昆山味精廠協(xié)作下完成了500L罐中試，產(chǎn)率穩(wěn)定在68%左右。1991年吳梧桐用K-卡拉膠固定黃色短桿菌膠，用0.3mol/LKCl作固化劑，膽汁酸作激活劑、半衰期為200d。以富馬酸鈉為底物，反應(yīng)生成L-蘋果酸鈉和剩余的富馬酸鈉。利用蘋果酸鈣溶解度比富馬酸鈣低的特性，將L-蘋果酸從混合液中分離出來。第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日L-蘋果酸生產(chǎn)現(xiàn)狀目前世界蘋果酸主要生產(chǎn)國有美國、加拿大、日本等，世界總產(chǎn)量每年約為10萬噸，其中L-蘋果酸產(chǎn)量每年約為4萬噸，而世界市場潛在需求量達(dá)到每年6萬噸，日本是世界主要的L-蘋果酸生產(chǎn)國與出口國主要生產(chǎn)廠商：日本扶桑化學(xué)公司，美國Denka化學(xué)公司，加拿大Batek化學(xué)公司以及英國、南非等，但這些公司是用化學(xué)合成法生產(chǎn)，產(chǎn)品為DL-蘋果酸，每噸售價萬元人民幣。日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的蘋果酸生產(chǎn)能力占世界生產(chǎn)能力之60%。由于D-蘋果酸不能被人體所利用，因此DL-蘋果酸的消費(fèi)市場將受到限制。1988年蘋果酸在美國酸味劑市場上占有率為4%．到1991年上升到4.5%。但由于蘋果酸的價格太高，故只用于特殊食品。一步發(fā)酵法一旦大規(guī)模投產(chǎn)，的價格將會有大幅度地下降。1997年Bayer公司稱，美國和歐洲軟飲料使用的酸味劑中，將減少檸檬酸用量，增加L-蘋果酸用量，尤其在使用二肽甜味劑時更能突出L蘋果酸風(fēng)味，改善口感，提高產(chǎn)品質(zhì)量。第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日目前我國的L-蘋果酸產(chǎn)量僅為1萬噸左右。主要企業(yè)有：常茂生物化學(xué)工程股份有限公司（產(chǎn)量3000噸），南京國海生物工程有限公司（產(chǎn)量1000噸），灤南九州生物化工有限公司（產(chǎn)量1000噸）。產(chǎn)量上還遠(yuǎn)落后于國外同行企業(yè)，可見市場發(fā)展空間之大。第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸的性質(zhì)以及用途蘋果酸的性質(zhì)蘋果酸又名羥基丁二酸或羥基琥珀酸性狀：無色結(jié)晶，易吸潮。相對密度(d420)1.595。熔點(diǎn)約130℃，沸點(diǎn)150℃(分解)。易溶于水，1g本品能溶于l.4mL醇、1.7mL醚、0.7mL甲醇、2.3mL丙醇、幾乎不溶于苯。具有酸味．結(jié)晶體，在水中具有旋光性。分子中含有一個不對稱碳原子，故有L-、D-、DL型3種。分子式：C4H6O5。HO-CH-COOH∣CH2-COOH第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日化學(xué)性質(zhì)蘋果酸用發(fā)煙硫酸處理可氧化得到75%-80%香豆酸(2-吡喃酮-5-羧酸)。蘋果酸的水溶液在Fe2+催化下與H2O2反應(yīng)生成草酰乙酸。蘋果酸在三氯化硼催化下，可與醇發(fā)生酯化反應(yīng)，形成蘋果酸酯。與多元醇，芳香多元羧酸作用，可形成樹脂類產(chǎn)品，如醇酸聚樹脂。蘋果酸酯在氨的醇溶液中能形成蘋果酸酰胺。第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸的用途

蘋果酸得最大用途在食品加工業(yè)，其次在醫(yī)藥行業(yè)和工業(yè)也有應(yīng)用。蘋果酸在食品行業(yè)的應(yīng)用：（1）蘋果酸具有明顯的呈味作用，其酸味柔和、爽快，與檸檬酸相比刺激性緩慢、保留時間長，具有特殊的香味，并且不損傷口腔和牙齒等特點(diǎn)。（2）蘋果酸常與人工合成的二肽甜味劑阿斯巴甜（天冬氨酰苯丙氨酸甲酯）

配合使用，作為軟飲料的風(fēng)味固定劑。(3)蘋果酸在醫(yī)學(xué)方面的作用：由于蘋果酸在物質(zhì)代謝途徑中所處的特殊位置，可直接參與人體代謝，被人體直接吸收，實(shí)現(xiàn)短時間內(nèi)向肌體提供能量，消除疲勞，起到抗疲勞、迅速恢復(fù)體力的作用。第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日

①、由于蘋果酸在物質(zhì)代謝途徑中所處的特殊位置，可直接參與人體代謝，被人體直接吸收，實(shí)現(xiàn)短時間內(nèi)向肌體提供能量，消除疲勞，起到抗疲勞、迅速恢復(fù)體力的作用利用蘋果酸的抗疲勞、護(hù)肝、腎、心臟作用可以開發(fā)保健飲料。②、代謝的正常運(yùn)行可以使各種營養(yǎng)物質(zhì)順利分解，促進(jìn)食物在人體內(nèi)吸收代謝，低熱量，可有效地防止肥胖，可以起到減肥的作用。③、在藥物中添加蘋果酸可增加其穩(wěn)定性，促進(jìn)藥物在人體的吸收、擴(kuò)散；復(fù)合氨基酸輸液生產(chǎn)中就是利用L-蘋果酸這一功能而用它來調(diào)節(jié)pH值的，同時作為混合氨基酸輸液組分之一，可提高氨基酸利用率，用于治療尿毒癥、高血壓等和減少抗癌藥物對正常細(xì)胞的侵害，用于癌癥放、化療后的輔助藥物，用于燒傷治療可以促進(jìn)傷口愈合。④、L-蘋果酸可以促進(jìn)氨代謝，降低血氨濃度，對肝臟有保護(hù)作用，是治療肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能障礙導(dǎo)致的高血氨癥的良藥。第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日⑤、L-蘋果酸作為治療心臟病基礎(chǔ)液成分之一，用于K+

、Mg2+的補(bǔ)充，保持心肌的能量代謝，對心肌梗塞的缺血性心肌層起到保護(hù)作用。⑥、L-蘋果酸是乳酸鈣注射液的穩(wěn)定劑，也可作為抗癌藥的前體及用作動物生長促進(jìn)劑。⑦、抗牙垢，蘋果酸具有酸度大、味道柔和、香味獨(dú)特及蘋果酸的腐蝕破壞作用比較弱，相應(yīng)的牙釉質(zhì)磨損體積損失較小，有不損害口腔和牙齒等特點(diǎn)。⑧、可以改善腦組織的能量代謝,調(diào)整腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì),有利于學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)，對學(xué)習(xí)記憶有明顯的改善作用第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日其他行業(yè)的應(yīng)用：蘋果酸具有抗氧化和較強(qiáng)的螯合作用，作為保色劑和增效劑，廣泛用于染料工業(yè)；用由于pH值調(diào)節(jié)，因此可作牙膏及煙草的調(diào)味劑、皮膚清潔劑、焊錫助焊劑、洗滌劑、廢氣脫硫劑、鍋爐水垢清潔劑、空氣清潔劑和除臭劑，特別是清除室內(nèi)魚腥臭、香煙臭及食品貯藏室的異味，代替檸檬酸作為各種金屬表面或容器的除銹劑。蘋果酸是制備特殊性能聚合物的單體，用蘋果酸聚合可合成生物降解塑料，有利于環(huán)境保護(hù)；在建材行業(yè)，蘋果酸添加在水泥中，可縮短凝固時間，防止堿性聚合反應(yīng)發(fā)生，提高混凝土的強(qiáng)度，代替草酸作為各種石塊的表面清洗劑，使其表面變得光滑、平整、美觀；蘋果酸還可作為飼料添加劑，改善汽車排氣質(zhì)量或應(yīng)用于海帶養(yǎng)殖業(yè)。第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸的生產(chǎn)方法目前采用的和發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化法相關(guān)的方法主要有：一步發(fā)酵法，二步發(fā)酵法，固定化細(xì)胞或酶法轉(zhuǎn)化。一步發(fā)酵法（1）一步發(fā)酵法產(chǎn)蘋果酸菌種的選育（2）一步發(fā)酵法發(fā)酵工藝與條件二步發(fā)酵法固定化細(xì)胞或酶法第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日一步發(fā)酵法

（1）一步發(fā)酵法產(chǎn)蘋果酸菌種的選育直接發(fā)酵法主要采用的微生物是：黃曲霉、米曲霉(Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Asp.parasiticus)、出芽短梗霉(Aureabasidiumpullulans)等。特點(diǎn)：三羧酸循環(huán)中蘋果酸到草酰乙酸這一步的蘋果酸脫氫酶缺失或處于低水平使得蘋果酸得以積累。第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日（2）一步發(fā)酵法發(fā)酵工藝與條件

一步發(fā)酵法又稱直接發(fā)酵法，即采用一種微生物直接發(fā)酵糖質(zhì)原料或非糖質(zhì)原料（如正構(gòu)烷烴）生成L-蘋果酸的方法。以糖類為原料，由黃曲霉、米曲霉等直接發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日金其榮等選出的黃曲霉T2803菌種，經(jīng)誘變劑聯(lián)合處理后經(jīng)，獲得株產(chǎn)酸較穩(wěn)定的菌種TH5007。可用薯干粉經(jīng)α-淀粉酶液化后作初糖進(jìn)行發(fā)酵，而在發(fā)酵中間加入葡萄糖，使總糖達(dá)到13%，發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸達(dá)7.33%，扣除雜酸，對糖轉(zhuǎn)化率為56.4%，發(fā)酵強(qiáng)度1g／(L．h)的結(jié)果。劉建軍等人從土壤中分離出幾株直接利用糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的黃曲霉菌株，經(jīng)紫外線、亞硝基胍,Co60,硫酸二乙脂等誘變處理、高酸和高滲透壓平板分離，獲得一株L-蘋果酸高產(chǎn)突變株黃曲霉HA5800，以100g/L的葡萄糖為碳源,35℃,200r/min搖瓶發(fā)酵120h,L-蘋果酸產(chǎn)率穩(wěn)定在72g/L以上，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)74.23%。傳代實(shí)驗(yàn)證明該菌株產(chǎn)酸性能穩(wěn)定吳清平等人以曲霉菌LMO2為出發(fā)株，選育出Nl-14、NEUl2、Nul416和Nul419。其中N1-14菌種可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖為碳源，最大發(fā)酵體積為20m3，發(fā)酵120h產(chǎn)L蘋果酸酸85.8g／L并己取得了中國專利(CN1112160)。以色列Battat等人報道黃曲霉(ATCC13697)以葡萄糖為碳源，16升發(fā)酵罐發(fā)酵，以葡萄糖為碳源，16升發(fā)酵罐發(fā)酵，通過條件優(yōu)化培養(yǎng)190小時，產(chǎn)酸高達(dá)11.3%。這些微生物最大的特點(diǎn)就是三羧酸循環(huán)中蘋果酸到草酰乙酸這一步的蘋果酸脫氫酶缺失或處于低水平使得蘋果酸得以積累。

第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日控制條件①生孢斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂斜面②錐形瓶培養(yǎng)基：麥芽汁，33℃靜止培養(yǎng)2～4d③種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，豆餅粉10，K2HPO4·3H200.2，MgSO4·7H2O0.1，NaCl0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O0.5，CaCO360(單獨(dú)滅菌)，MnSO4·H2O1.2第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日④發(fā)酵培養(yǎng)基采用葡萄糖70～80g/L，其余成分與種子培養(yǎng)基相同。種子培養(yǎng)基分別加入種子罐補(bǔ)足水量，加入泡敵(50L培養(yǎng)基加入20ml)抑制泡沫生成。并緩慢攪拌，0.1MPa實(shí)罐滅菌20～30min，冷卻至35℃左右加入已滅菌的CaCO3，并接種黃曲霉錐形瓶種子，在33～34℃，180r/min攪拌培養(yǎng)、通氣量0.15～0.3vvm，培養(yǎng)18～20h后接入發(fā)酵罐。發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制同上法,滅菌后降溫至34℃時，接入10%種子培養(yǎng)液，通氣攪拌進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時控制溫度33～34℃，通氣量0.7vvm，攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，自動流加泡敵控制泡沫生成，發(fā)酵周期約40h。待殘?zhí)墙档?.0g/L時，放罐提取。第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日金其榮使用薯干粉液化為碳源，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工序，有利于降低生產(chǎn)成本。薯干粉液化液分批發(fā)酵，不補(bǔ)加糖，發(fā)現(xiàn)初糖濃度9.7%時產(chǎn)酸最高。初糖濃度過高或過低，都不利于發(fā)酵產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率。吳清平等篩出的曲霉菌誘變株N1-14也具有糖化酶活力，也可以淀粉液化液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸。不同菌種對氮源的要求不同。例如金其榮等用的氮源對產(chǎn)L-蘋果酸的影響研究中，無機(jī)氮源，NaNO3和NH4NO3不利于產(chǎn)酸。0.5%豆餅粉效果較好，且較為經(jīng)濟(jì)。豆餅粉用量為0.3-0.5%,產(chǎn)L-蘋果酸最為理想，發(fā)酵液中總酸達(dá)7.0%左右。玉米粉中也含有一定量的氮源，而且玉米粉中也含有65%左右的淀粉。玉米粉用量低于0.5%時，對產(chǎn)酸不利。一般采用1.0%-1.5%玉米粉，此時也可扣除初糖的用量。無機(jī)鹽成分經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，K2HPO4,KH2PO4,FeSO4,MgSO4,MsSO4等對產(chǎn)酸有一定的影響。在正交實(shí)驗(yàn)中，用高壓液相色譜進(jìn)行分析時，初步認(rèn)為KH2PO4和K2HPO4濃度為0.015%-0.02%，以0.015%時為最佳。表列出了N1-14菌種20m3發(fā)酵罐數(shù)據(jù)。第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日二步發(fā)酵法二步發(fā)酵法即采用兩種不同功能的微生物，其中之一先將糖質(zhì)或其他原料轉(zhuǎn)化生成富馬酸（延胡索酸），另一種微生物將富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。二步發(fā)酵法，由于涉及到兩種微生物，培養(yǎng)條件要求比較嚴(yán)格，發(fā)酵周期較長，產(chǎn)酸率相對較低，副產(chǎn)物較多第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日蔣明珠等從41株根霉屬菌株中選出產(chǎn)富馬酸能力最高，同時產(chǎn)生部分L-蘋果酸的菌株R25，經(jīng)鑒定為無根根霉（Rhizopusarrhizus）,再用具有高富馬酸酶活力的普通變形桿菌（Proteeasvulgaris）P1.可將富馬酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸。無根根霉菌株R25在含有12g/dL葡萄糖的培養(yǎng)基中,31℃培養(yǎng)3天，完成了富馬酸的發(fā)酵。然后將在液體培養(yǎng)基中31℃培養(yǎng)2天的普通變形桿菌P1接入，在同樣的條件下發(fā)酵2天，L-蘋果酸的產(chǎn)量可達(dá)5.48g/dL。在含有18g/dL薯干粉培養(yǎng)基中發(fā)酵，能得到相同的產(chǎn)量，產(chǎn)物經(jīng)分離提純?yōu)榘咨Y(jié)晶，經(jīng)紙色譜，紅外光譜鑒定為蘋果酸。第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日華僑大學(xué)的胡純鏗等人采用A-23菌株和V-81菌株混合培養(yǎng)發(fā)酵L-蘋果酸，分別探討碳源濃度對A-23菌株和V-81菌株發(fā)酵水平的影響。實(shí)驗(yàn)表明，A-23菌株產(chǎn)延胡索酸能力強(qiáng)。V-81菌株具有高活性的延胡索酸酶，研究A-23菌株和V-81菌株混合培養(yǎng)方式對發(fā)酵L-蘋果酸的影響，結(jié)果表明A-23菌株接入含有150g/L葡萄糖的混合發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,后接入V-81菌株并繼續(xù)培養(yǎng)2天，產(chǎn)酸水平最高，L-蘋果酸濃度達(dá)73.3g/L,對糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)65.6%。第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日

N1-14菌種20m3發(fā)酵罐數(shù)據(jù)第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日固定化細(xì)胞或酶法利用具有高活性富馬酸酶的微生物細(xì)胞或富馬酸酶，采用固定化酶或細(xì)胞反應(yīng)器，將富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。雖然固定化細(xì)胞和固定化酶均有應(yīng)用，但由于酶的提取技術(shù)復(fù)雜，收率不高，成本昂貴，因而在實(shí)際生產(chǎn)中多用固定化細(xì)胞。采用的載體主要有藻酸鈣凝膠，角叉菜膠及聚丙烯酰氨凝膠等第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日有富馬酸酶活力的菌種有：產(chǎn)氨短桿菌（Brevibacteriumammoniagenes），黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum），假單胞桿菌（Pseudomonasfumarase），膜噗畢赤酵母（Pichiamembranaefaciens），皺褶假絲酵母（Candidarugose），馬棒桿菌（Corynebacteriumequi），大腸桿菌（E.coli），普通變形桿菌（Proteeasvulgaris），熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens），枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）和八疊球菌（Sarcinavarihils）。含有較高活性富馬酸酶的微生物有短桿菌，產(chǎn)氨短桿菌，黃氣短桿菌，解脂假絲酵母和溫特曲霉等。第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日黃騰華和王雪根，以富馬酸銨為酶反應(yīng)底物，選用黃色短桿菌，在16L發(fā)酵罐中培養(yǎng)20h，酶活力達(dá)到40000單位。12L發(fā)酵液得到的菌體制成容積為16L的固定化細(xì)胞，取其中8L裝成反應(yīng)柱，在37℃每天流過14%的富馬酸銨溶液100L，可產(chǎn)L-蘋果酸12.5%，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率近89.29%。楊廉婉等人以富馬酸為原料采用固定化細(xì)胞的方法生產(chǎn)蘋果酸。將發(fā)酵得到的微生物細(xì)胞用多孔珍珠巖粉吸附再用聚乙烯醇包埋，低溫固定化。固定化細(xì)胞的富馬酸酶回收率90%以上，產(chǎn)物對底物的轉(zhuǎn)化率80%以上。（91103606專利）第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日西德專利2450137公布了用聚丙烯酰胺凝膠包埋產(chǎn)延胡索酸酶的微生物細(xì)胞生產(chǎn)蘋果酸的方法。Yamamoto等也報道了用相似的辦法固定化產(chǎn)氨短桿菌連續(xù)生產(chǎn)蘋果酸的方法。Takata報道了用卡拉膠包埋黃色短桿菌連續(xù)生產(chǎn)蘋果酸的方法。中國專利92107642也描述了用卡拉膠包埋黃色短桿菌生產(chǎn)蘋果酸的方法。第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日該方法的劣勢：生產(chǎn)成本較高以化學(xué)合成原料富馬酸生產(chǎn)的蘋果酸存有疑慮，從混合液中把蘋果酸和富馬酸徹底分開難度較大，產(chǎn)品質(zhì)量很難達(dá)到出口要求所以這種方法生產(chǎn)蘋果酸也具有一定的局限性。該方法實(shí)施現(xiàn)狀日本自二十世紀(jì)70年代開始使用這種工藝小批量生產(chǎn)L-蘋果酸，但發(fā)展不快，產(chǎn)量至今不大。我國八十年代末九十年代初，固定化酶或細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-蘋果酸的研究達(dá)到了高潮，全國各地相繼建設(shè)了多條生產(chǎn)線，但由于固定化酶的轉(zhuǎn)化率低，半衰期短，國產(chǎn)富馬酸質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本相對較高，第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日對該方法的研究:固定化細(xì)胞酶活力穩(wěn)定性的研究固定化方法的選擇，主要包括固定介質(zhì)，細(xì)胞濃度，膽汁酸和膽氧膽酸濃度，溫度，底物濃度和pH值等因素。第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日⑴固定化黃色短桿菌生產(chǎn)L-蘋果酸流程

第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日此工藝一般包括兩步：一是固定化細(xì)胞的制備：將產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)成熟后，收集菌體細(xì)胞，包埋菌體，制備固定化酶或細(xì)胞，通常在37℃條件下運(yùn)行，轉(zhuǎn)化半衰期可達(dá)160天左右；二是L-蘋果酸制備：先將富馬酸和CaCO3反應(yīng)轉(zhuǎn)化為富馬酸鈣，經(jīng)提取得L-蘋果酸。目前這種方法生產(chǎn)蘋果酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%以上，第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日⑵斜面培養(yǎng)基普通肉膏瓊脂培養(yǎng)基⑶搖瓶種子培養(yǎng)基(g/dL)檸檬酸二胺2.0～3.0,玉米漿2.0～4.0,KH2PO4·3H2O0.2，MgSO4·7H2O0.05，尿素0.2，pH7.0，0.1MPa滅菌20min。⑷發(fā)酵培養(yǎng)基(g/dL)葡萄糖1.5，玉米漿1.5，富馬酸0.4，KH2PO4·3H2O0.1,MgSO4·7H2O0.05,尿素0.2,pH6.7～7.0,0.1MPa滅菌20min。第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日⑸發(fā)酵過程肉膏斜面菌種活化無菌水洗下1000ml搖瓶(內(nèi)裝300ml搖瓶培養(yǎng)基)

發(fā)酵罐每隔2～4h取樣測定。30℃16～24h少量無菌水洗下轉(zhuǎn)接至克氏瓶肉膏瓊脂表面上24h30℃搖床16～24h30℃12h30℃⑹收集活菌體發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)16000rpm離心15min，生理鹽水洗滌活菌體2次，每次洗滌離心15min，發(fā)酵液中菌體濃度為3%～4%，每次1g溫菌體的酶活力為2.0～2.5萬單位。第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日⑺菌體包埋以8g濕菌體加8ml生理鹽水將菌體制成懸浮液,放在溫水浴內(nèi),加溫使品溫達(dá)40～45℃?zhèn)溆?。?.5gK-卡拉膠加34ml蒸餾水，放在70～80℃熱水浴中攪拌，待卡拉膠充分溶脹后，慢慢冷卻至品溫45℃，立即將保溫的細(xì)胞懸浮液，迅速倒入卡拉膠液中,不斷攪拌10min，等其冷卻成型，放置2～10℃冰箱中，2h后取出，用0.3mol/LKCl浸泡4h，再切成3×3×3mm3小塊，整個操作在無菌條件下進(jìn)行。所得固定化細(xì)胞加入15ml由1mol/L富馬酸鈉內(nèi)含0.3%的膽酸組成的活化液，在37℃下保溫20～24h進(jìn)行活化，其目的是激活富馬酸的活力并抑制琥珀酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生。活化后的固定化細(xì)胞顆粒用0.1mol/LKCl洗滌2～3次，再用無離子水洗至無膽酸為止，裝柱待用。第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日⑻上柱前的準(zhǔn)備及酶轉(zhuǎn)化工業(yè)級富馬酸加NaOH配制成1∶1mol/L的富馬酸鈉溶液，pH7.0保溫37～40℃，然后將溶液上柱轉(zhuǎn)化。將底物溶液以恒速流過裝有固定化細(xì)胞的反應(yīng)柱,底物通過富馬酸酶轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。流出液中L-蘋果酸鈉濃度以0.85mol/L為標(biāo)準(zhǔn)，大于此值可適當(dāng)加快流速。流出液中已轉(zhuǎn)化好的L-蘋果酸鈉占大部分,在整個反應(yīng)過程中底物和柱的溫度要始終保持在37～40℃。至于固定化細(xì)胞內(nèi)酶活力的半衰期，據(jù)報導(dǎo)與菌種、固定化材料、工藝操作等因素有關(guān),據(jù)王博彥、金其榮研究,觀察6個月未見L-蘋果酸產(chǎn)率下降的現(xiàn)象。1972年千火田一郎用聚丙烯酰胺包埋產(chǎn)氨短桿菌制成固定化細(xì)胞，裝入充填柱內(nèi)進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)生產(chǎn)L-蘋果酸,算出在37℃時酶活力的半衰期為52.5d。第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸的提取和精制工藝蘋果酸的提純：鈣鹽沉淀法、吸附沉淀法、電滲析法。鈣鹽沉淀法：鈣鹽沉淀法包括轉(zhuǎn)化，過濾，酸解，過濾，凈化，濃縮，結(jié)晶，干燥等，流程鈣鹽沉淀法工藝流程第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日溶劑萃取法：近年來人們有提出了一種從水溶液中提取蘋果酸的工藝流程。該法以TRPO（三烷基氧化瞵）為萃取劑，以煤油為稀釋劑的萃取體系。于常溫下進(jìn)行萃取，然后再用去離子水進(jìn)行反萃，反萃溫度為60℃,萃取率為80%，

第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸精制采用離子交換和活性炭聯(lián)合處理，進(jìn)行除雜質(zhì)和脫色。濾清液送入高位槽，進(jìn)入酸性陽離子交換柱，再進(jìn)入弱堿性陽離子交換柱進(jìn)行脫鹽處理；再把凈化液引入真空濃縮罐中，在50～70℃下濃縮至1000～1300g/L，然后放入結(jié)晶罐中緩緩攪拌降溫至5～20℃，加入晶種，待晶體成長完成后，用離心機(jī)分出晶體，用少量無鹽水洗去晶面母液，收集濕晶,放入沸騰干燥床上，用30～60℃的干燥空氣干燥，干燥后的L-蘋果酸經(jīng)質(zhì)檢合格后即行包裝貯存。第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日蘋果酸的檢測和標(biāo)準(zhǔn)

蘋果酸生產(chǎn)相關(guān)的檢測技術(shù)主要:富馬酸酶活力的測定蘋果酸檢測方法⑴定性檢驗(yàn)⑵定量測定⑶富馬酸定量檢測①高錳酸鉀滴定法②紫外分光光度法③高效液相色譜法蘋果酸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日富馬酸酶活力的測定1.富馬酸酶活力的測定酶活力的含義即每毫升發(fā)酵液或每克濕菌體每小時消耗富馬酸的毫克數(shù)，即單位活力mg/(h.ml)或mg/(h.g

)。2、測定方法：取2ml發(fā)酵液,8000rpm離心，去清液，用生理鹽水洗滌活菌體，離心,再去清液。將活菌體置于37℃水浴中保溫5～10min。準(zhǔn)確吸取3ml在37℃水浴中保溫的底物(1mol/L富馬酸鈉含0.04%十六烷基溴化三鉀銨，50mmol/LKH2PO4·3H2O，pH7.0)，加入裝有菌體的小試管中，于37℃水浴中攪拌15min，立即將反應(yīng)試管放于沸水中加熱5min，中止反應(yīng)。離心取上清液，轉(zhuǎn)入容量瓶中，測富馬酸含量(從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出富馬酸含量，然后根據(jù)活力單位含義