高三一輪復(fù)習(xí)【高效課堂+備課精研】基因工程課件

一輪復(fù)習(xí)

基因工程基因工程按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。操作對(duì)象及環(huán)境操作水平操作原理結(jié)果生物體外基因DNA分子水平按照人類的需要定向改造生物的遺傳特性基因重組優(yōu)點(diǎn)：能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙；定向改造生物的遺傳特性。重組DNA分子胰島素基因DNA限制酶限制酶DNA連接酶載體重組DNA分子大腸桿菌導(dǎo)入考點(diǎn)一：重組DNA技術(shù)的基本工具1.來(lái)源：2.功能：3.作用的化學(xué)鍵：磷酸二酯鍵“分子手術(shù)刀”——限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱限制酶）主要從

中分離純化出來(lái)，目前分離出數(shù)千種。識(shí)別特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。磷酸二酯鍵原核生物（專一性）EcoRⅠATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵限制酶只切割兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵注意：限制酶是一類酶，而不是一種酶。幾種常見(jiàn)的限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由

個(gè)核苷酸組成，少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。6EcoRⅠBamHⅠTaqⅠHindⅢ限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’能被限制性酶特異性識(shí)別的序列一般都是回文序列：即正反讀順序相同，圍繞一條軸線對(duì)稱排列。讀：5’→3’EcoR

Ⅰ限制酶的切割

只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。AAGTTCCTTAAG

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。CTTAAGGAATTCSma

Ⅰ限制酶的切割

只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ:EcoRⅠ:Hind

Ⅲ:BglⅡ:GATCAATTAGCTGATC【思考】同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？

不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？相同可能會(huì)相同根據(jù)你所掌握的知識(shí)你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中作用是什么？旁欄思考細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌限制性內(nèi)切酶

限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來(lái)切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。拓展思維：要想從一個(gè)DNA分子中獲得某個(gè)特定的基因需要有幾個(gè)酶切位點(diǎn)？產(chǎn)生幾個(gè)末端？

24CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT使用EcoRⅠ酶剪切目的基因識(shí)別序列GAATTC在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內(nèi)切酶切割，會(huì)產(chǎn)生4個(gè)末端。請(qǐng)結(jié)合限制酶的作用特點(diǎn)，回答以下問(wèn)題：（1）限制酶能切開(kāi)RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能（2）請(qǐng)結(jié)合右圖，推斷限制酶切一次可斷開(kāi)

個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生

個(gè)黏性末端，消耗

分子水。

限制酶只能識(shí)別并切開(kāi)雙鏈DNA分子兩22兩為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？

通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。下圖甲是一個(gè)DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點(diǎn)，

據(jù)圖回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（3）只用PstⅠ酶切，最多能得到

種DNA片段。235（4）同時(shí)用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；52.DNA連接酶的種類：種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能特性相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)；既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端；恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵不能連接具有平末端的DNA片段。又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對(duì)較低）。“分子縫合針”——將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。1.作用:DNA連接酶E·coliDNA連接酶的縫合作用兩個(gè)DNA片段要具有互補(bǔ)（相同的）黏性末端才能連接起來(lái)把兩個(gè)DNA片段黏性末端間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接兩個(gè)雙鏈DNA片段中的DNA單鏈缺口，但不能直接連接兩條單鏈的DNA！DNA連接酶作用部位？是磷酸二酯鍵不是氫鍵DNA連接酶將兩個(gè)雙鏈DNA片段“縫合”連接起來(lái)，形成一個(gè)雙鏈DNA分子，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。T4DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率相對(duì)較低。T4DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATT連接兩個(gè)DNA片段DNA連接酶和DNA聚合酶的比較CAATTGAGTATCDNA聚合酶以DNA母鏈為模板，連接單個(gè)脫氧核苷酸形成單鏈DNA聚合酶作用示意圖比較DNA連接酶和DNA聚合酶種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)催化

加到已有脫氧核苷酸片段上，形成

.

催化兩個(gè)

之間形成

.

作用結(jié)果催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有

黏性末端或平末端的

連接起來(lái)，形成

.

模板

.

.

相同點(diǎn)①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)；②都是催化形成

.兩個(gè)DNA片段磷酸二酯鍵不需要互補(bǔ)DNA片段重組DNA分子單個(gè)脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵需要DNA連接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比較項(xiàng)目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用對(duì)象作用結(jié)果磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵DNA片段DNA單個(gè)的脫氧核苷酸DNADNA將兩個(gè)DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個(gè)的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”1.作用：將目的基因送入受體細(xì)胞

（

能在受體細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制）2.最常用的載體——質(zhì)粒質(zhì)粒：一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。大腸桿菌細(xì)胞擬核DNA質(zhì)粒思考：質(zhì)粒有___個(gè)游離的磷酸基團(tuán)0①有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)供外源DNA片段（基因）插入其中②在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制，以擴(kuò)增外源基因的數(shù)量思考：質(zhì)粒為什么適合作為載體？作為載體需要具備那些條件？（1）作用:①

．

②

．（2）作為運(yùn)載體需具備的條件:

①

．

②

．

③

．

④

等．（3）種類將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存有1個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害種類用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”1：λ噬菌體的衍生物或某些動(dòng)植物病毒作為運(yùn)載體利用的原理是

.病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異2：若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲(chóng)病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶3：霍亂弧菌中含有質(zhì)粒，但

（填“能”、“不能”）用來(lái)做載體，因?yàn)檫x擇的載體應(yīng)該

。對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害不能4：質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的

（化學(xué)本質(zhì)）雙鏈環(huán)狀DNA分子5：標(biāo)記基因的作用是

。用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞

質(zhì)粒的自身環(huán)化

由于用同種限制酶切割，會(huì)產(chǎn)生相同黏性末端，則可能導(dǎo)致目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接。思考：(1)獲取目的基因和切割載體時(shí),通常使用同種限制酶,目的是為了

。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生

以及

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質(zhì)粒反向連接目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體(2)獲取一個(gè)目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。兩4(3)選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：①切割目的基因時(shí)：

。②切割質(zhì)粒時(shí)：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選總結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E·coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)或多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、噬菌體

、動(dòng)植物病毒1．如圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶B．終止子位于基因的下游，使翻譯在所需要的地方停止下來(lái)C．構(gòu)建成功后可使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代D．抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因2．(2021·全國(guó)乙卷改編)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中_____________________________________________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是_______________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能________________________；質(zhì)粒DNA分子上有_____________________________________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是______________

_______________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指____________________________

_______________________________________________________________。磷酸二酯鍵

自我復(fù)制

一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)

用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞

位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程

【探究?實(shí)踐】DNA的粗提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理1.粗提取DNA的原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對(duì)DNA進(jìn)行提取。①在酒精溶液中的溶解性：②在NaCl溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。2.鑒定DNA的原理在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。二、材料用具1.選材：【思考】能否選用牛、羊、馬、豬等哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？不能哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無(wú)細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。【思考】能否選用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？能雞是鳥(niǎo)類動(dòng)物1.取材、研磨：稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨研磨的目的？破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中三、方法步驟2．去除濾液中的雜質(zhì)方案一方案二在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過(guò)濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。低溫放置幾分鐘的作用？抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解。3.DNA的析出方案一方案二在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子?；?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。4.DNA的鑒定實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組水浴加熱取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。藍(lán)色材料的獲取與研磨去雜，析出DNADNA的鑒定DNA鑒定的結(jié)果方法步驟3．下列關(guān)于“DNA的粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)的原理的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質(zhì)能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質(zhì)分離B．利用高溫能使蛋白質(zhì)變性，卻對(duì)DNA沒(méi)有影響的特性，可將DNA與蛋白質(zhì)分離C．在用預(yù)冷的酒精沉淀DNA時(shí)，要用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，防止DNA斷裂D．利用DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，可將提取的絲狀物或沉淀物溶解于NaCl溶液中4．多種實(shí)驗(yàn)材料都可以用于DNA的粗提取與鑒定，用香蕉也可以取得較好的實(shí)驗(yàn)效果。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．將粗提取的DNA加入到2mol/L的NaCl溶液的目的是溶解DNAB．冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精可以溶解某些蛋白質(zhì)，得到粗提取的DNAC．向剪碎的香蕉果肉組織中加入蒸餾水并研磨，以釋放核DNAD．將DNA溶于NaCl溶液后加入現(xiàn)配的二苯胺試劑，沸水浴后會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序一輪復(fù)習(xí)

基因工程抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)（1）原核生物基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)

組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游

功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成一.目的基因的篩選與獲取---基因的結(jié)構(gòu)信使RNA加工mRNA前體成熟mRNA不能編碼蛋白質(zhì)的序列=內(nèi)含子+非編碼區(qū)序列編碼序列=外顯子12345一.目的基因的篩選與獲取---基因的結(jié)構(gòu)（2）真核生物基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄初級(jí)RNA成熟mRNA3啟動(dòng)子真核細(xì)胞基因編碼區(qū)中的內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，但表達(dá)時(shí)是否轉(zhuǎn)錄？

剪切、拼接不完全相同原因：基因的選擇性表達(dá)。同一個(gè)體不同體細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)是否相同

一、目的基因的獲取和篩選1.目的基因概念：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)基因。主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因1.從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。如：Bt基因的篩選蘇云金桿菌制成殺蟲(chóng)劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲(chóng)蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因。2.目的基因獲取方法從基因文庫(kù)中獲取通過(guò)DNA合成儀直接合成利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（主要是cDNA文庫(kù)）基因文庫(kù)：從基因文庫(kù)中直接獲?。夯蚪M文庫(kù)：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。部分基因文庫(kù)：含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。與載體連接導(dǎo)入受體菌群用適當(dāng)限制酶切割（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA許多DNA片段該生物基因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA（某一發(fā)育時(shí)期）逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈cDNA(cDNA)與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)中的基因含有啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子。cDNA文庫(kù)中的基因不含以上結(jié)構(gòu)人工合成：DNA合成儀（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因提取蘇云金芽孢桿菌抗蟲(chóng)基因？快速獲得大量抗蟲(chóng)基因利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因：PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，通過(guò)在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。體內(nèi)DNA復(fù)制要點(diǎn)回顧:條件原料：游離的脫氧核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的兩條鏈酶：解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP復(fù)制原則:堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因：PCR擴(kuò)增儀知道目的基因的兩端核苷酸序列，基因又比較大前提：CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子鏈CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶形成磷酸二酯鍵子鏈延伸合成的方向？只能從5′－端→3′－端延伸CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶1.體外PCR的條件：dATPdGTPdCTPdTTP3′5′子鏈的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈因?yàn)镈NA聚合酶不能直接將單個(gè)的核苷酸聚合成鏈DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端子鏈合成需要引物引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個(gè)核苷酸。在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。a.什么是引物1.體外PCR的條件：

在DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶不能直接從模板鏈的一端直接開(kāi)始臺(tái)成子鏈，必須由引物提供3’端之后才能開(kāi)始連接脫氧核苷酸。3’3’3’3’5’5’5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’DNA解鏈為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過(guò)程可以在PCR擴(kuò)增儀(PCR儀)中自動(dòng)完成。2.PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程：第1步：變性當(dāng)溫度超過(guò)90℃時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈。2.PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程：5’3’3’5’5’3’3’5’955072℃預(yù)變性90℃以上增加大分子模板DNA徹底變性的概率長(zhǎng)度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高。當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。5’3’3’5’第2步：復(fù)性5’3’3’5’當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第3步：延伸第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’每次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即形成指數(shù)式擴(kuò)增(2n)。利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因用于PCR擴(kuò)增的DNA片段往往為了保證目的基因的完整，經(jīng)切割后目的基因的兩端會(huì)有一小段非基因序列，其也可能隨目的基因一起擴(kuò)增。PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過(guò)幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？AACGGCTTAATT第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開(kāi)50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循環(huán)5’3’5’5’3’5’高溫變性、低溫復(fù)性中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性第三次循環(huán)3’5’中溫延伸第三次循環(huán)3’5’PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段的分析（1）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)1次循環(huán)后產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段有

個(gè)；（2）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)2次循環(huán)后產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段有

個(gè)；（3）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)3次循環(huán)后產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段有

個(gè)；（4）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)4次循環(huán)后產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段有

個(gè)；（5）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)5次循環(huán)后產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段有

個(gè)；（6）含目的基因的DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后產(chǎn)生等長(zhǎng)的目的基因片段有

個(gè)。0028222n–2n要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。如果循環(huán)n次，則共需消耗

個(gè)引物。

則共需消耗

對(duì)引物。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2如果循環(huán)n次，則共需消耗

個(gè)引物。

則共需消耗

對(duì)引物。2n－12n+1－2兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的

端；脫氧核苷酸連接在引物的

端進(jìn)行延伸。3’設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是？已知目的基因兩端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根據(jù)該序列合成引物。

3’3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2呈指數(shù)形式擴(kuò)增（n次擴(kuò)增后，DNA數(shù)量約為2n）PCR結(jié)果：①n代后，DNA分子有_____個(gè)

②n代后，DNA鏈有_____條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因

④n代后，含引物的DNA分子有_____個(gè)⑤n代后，共消耗_____個(gè)引物

⑥第n代復(fù)制，消耗了______個(gè)引物⑦n代后，完整的目的基因有____個(gè)2n2n+132n2n+1-22n2n-2n如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就叫電泳。思考?瓊脂糖凝膠電泳梳子模具根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，一般配置質(zhì)量體積比為0.8%~1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。1將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。2待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。3點(diǎn)樣孔電泳槽樣品將電泳緩沖液加入電泳槽中，電容緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。4將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。5接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為

1～5V/cm2。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。6取出凝膠，至于紫外燈下觀察和照相。7PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式場(chǎng)所引物酶溫度結(jié)果聯(lián)系解旋酶催化，邊解旋邊復(fù)制高溫變性解旋，全部解旋后再?gòu)?fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))RNA通常是DNA解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）細(xì)胞內(nèi)溫和條件在不同溫度(較高)下進(jìn)行合成整個(gè)DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板③原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）②酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3’端合成子鏈1.目的基因的獲取和篩選【三點(diǎn)提醒】①在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。脫氧核苷三磷酸PCR技術(shù)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA的半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖所示)，在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。(1)PCR的全稱是_________________________94℃高溫使DNA雙鏈打開(kāi)，這一步是打開(kāi)______鍵，稱為_(kāi)______。而這一過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)______酶實(shí)現(xiàn)的。(2)當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板_____端結(jié)合，在___________________的作用下，DNA單鏈沿模板延伸，此過(guò)程中原料是_______________，遵循的原則是________________________。(3)PCR技術(shù)的必要條件除模板、原料、ATP、酶以外，至少還需要三個(gè)條件，即液體環(huán)境、適宜的_______和________，前者由PCR儀自動(dòng)調(diào)控，后者則靠_________來(lái)維持。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)氫變性解旋耐高溫的DNA聚合酶脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則溫度pH緩沖液(4)DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是__________________________

___________________________________________________。引物的實(shí)質(zhì)是_______________________________，若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖溶液中至少加入__________個(gè)引物。單鏈RNA或者單鏈DNA分子

金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬?gòu)U水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳__________________________位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間出現(xiàn)___________________，干擾引物與模板的結(jié)合。(2)圖中步驟1代表_____________，步驟2代表復(fù)性，步驟3代表____，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。(3)PCR擴(kuò)增時(shí)，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)影響_________________________的堿基配對(duì)。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但_____________的引物需要設(shè)定更高的復(fù)性溫度。限制性內(nèi)切核酸酶切割堿基互補(bǔ)配對(duì)變性(解旋)延伸引物與模板GC含量高(4)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有_____。(填序號(hào))①升高復(fù)性溫度②降低復(fù)性溫度③重新設(shè)計(jì)引物②③

一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，終止轉(zhuǎn)錄。篩選含目的基因(重組DNA分子)的受體細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作?；虮磉_(dá)載體的組成【說(shuō)明】有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體上人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。啟動(dòng)子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別

項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號(hào)決定翻譯過(guò)程的結(jié)束不編碼氨基酸編碼氨基酸啟動(dòng)子與終止子位于DNA分子中，起始和終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程。啟動(dòng)密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，起始和終止翻譯過(guò)程。(1)基因工程中的基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了

。

目的基因(2)目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。啟動(dòng)子和終止子之間的部位注意:基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）①單酶切單酶切缺點(diǎn):質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）②雙酶切的優(yōu)點(diǎn):防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問(wèn)題：

構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選?！竞诵臍w納】圖解限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。（2）保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或?yàn)榱吮ＷC目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接），可選用什么限制酶？可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。下圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列敘述錯(cuò)誤的是A.應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶GB.所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出

含重組質(zhì)粒的受體菌D.同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，電泳后可得到4個(gè)條帶注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因，TetR：四環(huán)素抗性基因C轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)方法：植物細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞：微生物細(xì)胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射技術(shù)Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有差別；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞花粉外源DNA花粉管子房胚珠1.花粉管通道法：②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過(guò)花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊。我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中雙子葉、裸子植物傷口分泌酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)受損將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞中，并且將其整合到該細(xì)胞染色體DNA上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法激活Vir區(qū)基因，導(dǎo)致T-DNA加工和轉(zhuǎn)移特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力；b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上；c.利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法：可轉(zhuǎn)移的DNA第一次拼接第二次拼接第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中兩次拼接、兩次導(dǎo)入的辨析a.兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的

上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞

上。b.兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入

第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基因的

導(dǎo)入受體細(xì)胞。T-—DNA染色體DNAT-—DNA農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；體細(xì)胞b.可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受精卵受體細(xì)胞為？受體細(xì)胞為？【說(shuō)明】隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，利用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。表達(dá)載體提純受精卵胚胎雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)顯微注射早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植新性狀的動(dòng)物發(fā)育3.顯微注射法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞病毒介導(dǎo)法（主要用于導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞）

科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對(duì)S蛋白的免疫記憶。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Ca2+

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞吸收大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合表達(dá)載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化Ca2+處理法使大腸桿菌處于一種易于吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子

在棉花細(xì)胞中，重組表達(dá)載體是否導(dǎo)入成功？是否可以穩(wěn)定維持并表達(dá)出Bt蛋白？表達(dá)出的Bt蛋白是否具有殺蟲(chóng)的功效？4.目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。1.目的：2.檢測(cè)內(nèi)容及方法：類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖分子水平的檢測(cè)——基因是否插入染色體DNA（存在）非轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉陰性對(duì)照Marker方法：PCR擴(kuò)增或DNA分子雜交技術(shù)DNA分子雜交結(jié)果圖分子水平的檢測(cè)——基因是否轉(zhuǎn)錄方法：RT-PCR或分子雜交技術(shù)RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖Bt基因在抗蟲(chóng)棉中的表達(dá)從左至右依次是苗期葉片、花鈴期葉片，苞葉，花，雌雄蕊和鈴殼Bt抗蟲(chóng)蛋白4.目的基因的檢測(cè)與鑒定分子水平的檢測(cè)——基因是否翻譯為蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交4.目的基因的檢測(cè)與鑒定個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定——個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀方法：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、抗蟲(chóng)或抗病接種實(shí)驗(yàn)與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較接種棉鈴蟲(chóng)觀察性狀表現(xiàn)，或采摘抗蟲(chóng)棉的葉子飼喂棉鈴蟲(chóng)，觀察抗蟲(chóng)效果。個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定具體方法舉例轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽堿植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病一定濃度的鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過(guò)程，如下圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是_______；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為_(kāi)________。該方法中農(nóng)桿菌的作用是______________________________________________________。Ti質(zhì)粒T－DNA感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入到煙草細(xì)胞的染色體DNA上(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是____________________________________________________________________。防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長(zhǎng)繁殖，農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。為什么？__________________________________________。否含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞科學(xué)家通過(guò)利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)改造Rubisco酶基因，提高了光合作用過(guò)程中Rubisco酶對(duì)CO2的親和力，從而顯著提高了植物的光合作用速率，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）PCR過(guò)程所依據(jù)的原理是_______________，該過(guò)程需要加入的酶是________________________。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成_______________。（2）該技術(shù)不直接改造Rubisco酶，而通過(guò)對(duì)Rubisco酶基因進(jìn)行改造，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較，定點(diǎn)突變技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是__________________________________，PCR定點(diǎn)突變技術(shù)屬于________________的范疇.（3）可利用定點(diǎn)突變的DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體，常用__________________將基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，將該細(xì)胞經(jīng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育成幼苗，從細(xì)胞水平分析所依據(jù)的原理是__________________________。DNA雙鏈復(fù)制耐高溫的DNA聚合酶（或Taq酶）引物能生產(chǎn)出自然界不存在的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，改造困難蛋白質(zhì)工程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法植物細(xì)胞的全能性5.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.DNA體外擴(kuò)增的原理：PCR利用DNA熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2.DNA片段電泳鑒定的原理：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。如何對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定嗎？瓊脂糖凝膠電泳PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1gp～1μg方法步驟

用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分。1.PCR加樣：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min2.離心：3.擴(kuò)增：將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。4.配制瓊脂糖溶液：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。

將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。

凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。5.制備凝膠：將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。6.電泳加樣：7.電泳、觀察：

接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。【思考】用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過(guò)程是：第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的使之變成單鏈DNA；第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA鏈，形成雙鏈DNA分子(圖3-1)。(2021·全國(guó)甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測(cè)。為檢測(cè)病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是______________(用數(shù)字序號(hào)表示)。(2)操作③中使用的酶是_____________________________。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是____________________________。④②③①

耐高溫的DNA聚合酶

延伸

引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈

(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與____________

______________特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指_______________________________

_________________________________________________________。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。病原菌的DNA解旋成的單鏈

在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)

新冠疫情的快速控制，離不開(kāi)政府的科學(xué)決策和我國(guó)對(duì)新冠病毒(RNA病毒)的快速檢測(cè)能力。熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接受到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成(如圖)。Ct值(循環(huán)閾值)的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說(shuō)法不正確的是(

)A．檢測(cè)新冠病毒時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNAB．PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)合)、延伸3個(gè)階段C．Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高D．若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，檢測(cè)結(jié)果可能為陰性解析Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越少，患者危險(xiǎn)性更低，C錯(cuò)誤；若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，則逆轉(zhuǎn)錄無(wú)法得到相應(yīng)DNA，檢測(cè)結(jié)果可能為陰性，D正確。(2021·湖南選擇性考試節(jié)選)M基因編碼的M蛋白在動(dòng)物A的肝細(xì)胞中特異性表達(dá)?，F(xiàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通過(guò)核移植、胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等技術(shù)獲得M基因失活的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物A，流程如圖所示。回答下列問(wèn)題：(1)在構(gòu)建含有片段F的重組質(zhì)粒過(guò)程中，切割質(zhì)粒DNA的工具酶是_____________________________，這類酶能將特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的__________________斷開(kāi)。(2)在無(wú)菌、無(wú)毒等適宜環(huán)境中進(jìn)行動(dòng)物A成纖維細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)時(shí)，需要定期更換培養(yǎng)液，目的是_________________________________

__________________________________________________。(3)與胚胎細(xì)胞核移植技