基因分析的基本策略課件

從上世紀(jì)70年代以來，與DNA、RNA操作相關(guān)的各種分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，到目前已經(jīng)形成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的技術(shù)體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學(xué)研究的重要手段。簡單地說，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技術(shù)。本章主要討論如何對基因進(jìn)行定性、定量分析；在隨后的2章里分別介紹基因功能研究的技術(shù)和基因工程的有關(guān)內(nèi)容。第六章基因分析的基本策略從上世紀(jì)70年代以來，與DNA、RNA操作相關(guān)的1、需要進(jìn)行基因的DNA序列分析:序列測定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術(shù)3、研究基因在基因組中的拷貝數(shù)：SouthernBlot4、研究基因表達(dá)水平：NorthernBlot、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR技術(shù)5、研究基因表達(dá)產(chǎn)物的水平：WesternBlot、流式細(xì)胞儀（FACS）對一個(gè)已知或未知基因的內(nèi)容進(jìn)行研究步驟：1、需要進(jìn)行基因的DNA序列分析:序列測定對一個(gè)已知或未知基第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度對基因和基因組進(jìn)行研究一、DNA序列測定可以揭示基因和基因組一級結(jié)構(gòu)變化DNA測序技術(shù)：

1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法)2、化學(xué)裂解法

3、PCR測序技術(shù)

4、全自動DNA測序儀這些技術(shù)的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度一、DNA序列測

Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。

如果在DNA的合成反應(yīng)中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，T的位置上。對這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測序方法原理Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ基因分析的基本策略基因分析的基本策略基本步驟：1、先將DNA的末端之一標(biāo)記放射性同位素（32P、35S），2、再將DNA樣品分別進(jìn)行多組具堿基特異性、隨機(jī)的、不完全的化學(xué)修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學(xué)試劑在修飾堿基位置斷開DNA鏈；4、通過具有可分辨鏈長短僅一個(gè)核苷酸之差的聚丙烯胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分離開5、根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標(biāo)記片段分布情況，直接讀出DNA序列。化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert）

1977基本步驟：化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert）反應(yīng)體系堿基修飾堿基修飾主鏈斷裂斷裂點(diǎn)試劑反應(yīng)試劑

G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G/AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C/TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C在化學(xué)修飾反應(yīng)中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾，隨后進(jìn)行斷裂反應(yīng)也是定量。反應(yīng)體系堿基修飾堿基修飾5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼（加鹽）5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACDNA自動測序儀上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模DNA測定需要。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點(diǎn)，特別是讀結(jié)果的讀片過程。1987年發(fā)明了一種準(zhǔn)確快速的DNA測序方法，即激光測序法和配套的自動測序儀。（用熒光染料結(jié)合引物）。隨后又發(fā)明了終止標(biāo)記系統(tǒng)法。DNA自動測序儀上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模DNA測定需要。存1、揭示基因和基因組一級結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。2、通過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、通過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、通過DNA序列測定對定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)。

DNA序列測定的意義1、揭示基因和基因組一級結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。D分析基因拷貝數(shù)變化一、Southernblot檢測基因拷貝數(shù)變化Southernblot印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固定支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。

1975年英國愛丁堡大學(xué)的Southern建立了該方法，Southern印跡雜交由此得名。分析基因拷貝數(shù)變化一、Southernblot檢測基因拷Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化水解基因組DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待測DNA樣品的電泳分離。（3）凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段始終保持雙鏈結(jié)構(gòu)。電泳結(jié)束后DNA變性并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)墓潭ㄖС治锷喜拍苓M(jìn)行Southernblot。變性通常用堿變性法。Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取（4）Southern轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性并將PH恢復(fù)中性后，即可將凝膠中DNA轉(zhuǎn)移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素（NC）膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等。轉(zhuǎn)移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印跡法、真空轉(zhuǎn)移法。（5）已知序列的DNA探針的制備（4）Southern轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性并（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進(jìn)行雜交前，必須先進(jìn)行一個(gè)預(yù)雜交的過程。因?yàn)槟軌蚪Y(jié)合DNA的膜同樣可以和探針DNA結(jié)合，在進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉。（7）雜交結(jié)果的檢測：采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交時(shí)，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經(jīng)沖洗，在X線片上可見黑色條帶。（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探1、對某種生物體基因組拷貝數(shù)研究，需要完整提取出基因組，并需要適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切；2、通常要研究的基因序列是已知的。Southernblot檢測基因拷貝數(shù)注意事項(xiàng)1、對某種生物體基因組拷貝數(shù)研究，需要完整提取出基因組，并需二、采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)原理：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，PCR原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對簡單。PCR反應(yīng)體系：耐熱的TaqDNA聚合酶、化學(xué)合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及合適的緩沖液體系。PCR反應(yīng)的基本過程：變性、退火、延伸二、采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)原理：基因分析的基本策略PCR技術(shù)對擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以一個(gè)恒定的指數(shù)率上升，但經(jīng)過25至30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)量會達(dá)到一個(gè)平臺期，同時(shí)PCR過程中，還會出現(xiàn)“試管效應(yīng)”，因些對不同樣本量的比較無法直接用PCR技術(shù)來鑒定。近年來，隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示PCR和實(shí)時(shí)PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。PCR技術(shù)對擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以

是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)PolyA序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。（1）差異顯示PCR用于基因拷貝數(shù)分析是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端

盡管應(yīng)用

差異顯示PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進(jìn)之中，但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問題：但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問題：(1)重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)；(2)假陽性率可以高達(dá)90%；(3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。盡管應(yīng)用

差異顯示PCR方法已經(jīng)取得了不少成果（2）、代表性差異分析技術(shù)該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合形成的一種方法.主要步驟:1、將對照組(driver)和待測組(tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段群,接上接頭進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增;2、將兩組PCR產(chǎn)物片段群用限制性內(nèi)切酶酶切,形成平均長度256bp的長度.3、將接頭消化,在tester組末端接上新的接頭,tester組和driver組按1:100比例混合.過量的driver可與tester中互補(bǔ)的部分形成雙鏈.4\復(fù)性,按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第2輪PCR，只有tester和tester雜合體才能和引物配對,大量拉增.（2）、代表性差異分析技術(shù)該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合

實(shí)時(shí)PCR根據(jù)PCR反應(yīng)動力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。在PCR反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)體系中的模板的產(chǎn)物深度較低，而引物是過量的，產(chǎn)物和模板復(fù)性不會形成與引物競爭，此時(shí)產(chǎn)物含量呈指數(shù)增加。當(dāng)PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競爭引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物增加減慢，最后進(jìn)入平臺期。所以對樣品中的cDNA進(jìn)行定量分析的最佳時(shí)期是反應(yīng)早期。有人試圖依靠循環(huán)次數(shù)減少來分析樣品中的cDNA含量，但因樣品的差異使之很不可靠。在一定的循環(huán)中，mRNA豐度低的樣品產(chǎn)量少，可能尚不能檢測，豐度高的樣品可能已進(jìn)入平臺期，故難以較。（3）實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析實(shí)時(shí)PCR根據(jù)PCR反應(yīng)動力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的

實(shí)時(shí)PCR原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號的變化計(jì)算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)在寡核苷酸探針的5`端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料，3`端標(biāo)記一個(gè)猝滅染料。當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激活的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當(dāng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切探針成正比，由此可以計(jì)算出PCR產(chǎn)物的含量。實(shí)時(shí)PCR原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入基因分析的基本策略實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。實(shí)時(shí)PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。

核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。原位雜交不需要從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可完整保持組織與細(xì)胞形態(tài)，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理

根據(jù)檢測對象不同可將原位雜交分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交。同時(shí)原位雜交既可檢測DNA，也可檢測RNA，所用探針不同而以。核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，非放射性探針可以用生物素、地高辛、熒光素標(biāo)記探針。根據(jù)檢測對象不同可將原位雜交分為細(xì)胞內(nèi)原（一）、固定：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。（二）、玻片和組織切片的處理：包括玻片處理、細(xì)胞組織切片的處理、降低背景、預(yù)雜交。（三）雜交：調(diào)整探針的濃度（0.5～5.0ng/μl）、探針長度（50～100個(gè)堿基）、雜交的溫度和時(shí)間（四）雜交后處理：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。（五）顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。（六）結(jié)果分析基本方法（一）、固定：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RN

真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最為熱點(diǎn)。它的研究可以提示基因的結(jié)構(gòu)、基因的活性、或基因的變異等。

mRNA研究常用的方法有Northernblot、原位雜交、實(shí)時(shí)PCR、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)、cDNA芯片技術(shù)和RT-PCR。第二節(jié)

利用RNA定性定量分析可從不同角度揭示基因表達(dá)活性真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、Northernblot印跡雜交是指待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固-液相雜交。原理同Southernblot。但因Northernblot印跡雜交法檢測的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時(shí)，所需器皿均需要特殊處理。同時(shí)作為監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)RNA含量不夠準(zhǔn)確，只能作為定性分析RNA方法。（一）Northernblot定性分析RNA的常用方法Northernblot印跡雜交是指待RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴(kuò)增cDNA的技術(shù)。其基本程序是：提取細(xì)胞總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行特定基因的PCR擴(kuò)增。因?yàn)镻CR擴(kuò)增產(chǎn)物有平臺效應(yīng)，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。但如果將陽性參照基因作為內(nèi)參照與待測RNA在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，可以對RNA進(jìn)行相對定量分析。參照基因：β-肌動蛋白（β-actin）、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等。（二）RT-PCR用于定性、定量分析RNA方法RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外三、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)—了解基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接

RNA酶保護(hù)試驗(yàn)是利用RnaseA和RnaseT1能專一的降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護(hù)的特性，用體外轉(zhuǎn)錄合成的放射性核素標(biāo)記的RNA探針與待檢測mRNA進(jìn)行液相雜交，使RNA探針和待測RNA間在互補(bǔ)序列處形成雜交體，然后用RnaseA和RnaseT1切割此RNA雜交體，受到保護(hù)的RNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，從而估計(jì)待檢測mRNA情況。RNA酶保護(hù)試驗(yàn)：可用于①mRNA定量、②mRNA末端定位、③mRNA剪切部位④確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置。三、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)—了解基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接RRNA酶保護(hù)試驗(yàn)：全新的mRNA定量分析方法

其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。RNA酶保護(hù)試驗(yàn)：全新的mRNA定量分析方法

監(jiān)測大量基因表達(dá)的最好方法之一是cDNA微陣列技術(shù)，利用這種技術(shù)可以同時(shí)測定成千上萬個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性。

cDNA微陣列技術(shù)的基本原理與核酸分子雜交方法是一樣的。都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性或定量分析基因的表達(dá)情況。利用cDNA微陣列能在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)行大量的信息篩選和檢測分析。三、cDNA微陣列（cDNA芯片）可同時(shí)分析大量基因的轉(zhuǎn)錄活性監(jiān)測大量基因表達(dá)的最好方法之一是cD

目前研究蛋白質(zhì)的技術(shù)一般多采用免疫印記技術(shù)（Westernblot）或免疫組化染色對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。目前在1、研究轉(zhuǎn)基因的活性。2、研究克隆基因的表達(dá)。上必須選用蛋白質(zhì)技術(shù)對基因的表達(dá)活性進(jìn)行分析。第三節(jié)利用蛋白質(zhì)的定性定量定位分析揭示基因的表達(dá)活性目前研究蛋白質(zhì)的技術(shù)一般多采用免疫印記Westernblot是一種免疫印記技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子。

基本過程：蛋白質(zhì)樣品制備和SDS分離；蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜；標(biāo)記的抗體與膜上蛋白質(zhì)的抗原抗體雜交；檢測并分析標(biāo)記物信號。（一）Westernblot可對細(xì)胞總蛋白中的特定基因產(chǎn)物進(jìn)行鑒定Westernblot是一種免疫印記技

流式細(xì)胞術(shù)也稱為熒光激活細(xì)胞分揀技術(shù)。是一種快速定量分析細(xì)胞的新技術(shù)。其基本原理也是抗原抗體的特異結(jié)合，但抗原一般位于活細(xì)胞表面或內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子，用熒光標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)其信號的強(qiáng)弱，來判斷細(xì)胞內(nèi)某基因的表達(dá)活性。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的外源基因表達(dá)情況也可以采用此法。二、流式細(xì)胞術(shù)可在細(xì)胞水平上分析特定蛋白質(zhì)流式細(xì)胞術(shù)也稱為熒光激活細(xì)胞分揀技術(shù)。是

免疫組化其基本原理是利用顯色劑標(biāo)記的特異抗體在組織或細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)顯色反應(yīng)檢測特定抗原。免疫組化將免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性和顯微鏡的顯像和放大作用巧妙地結(jié)合起來，成為蛋白質(zhì)水平分析基因的直觀特異的方法之一。（三）免疫組化方法可對細(xì)胞內(nèi)或組織中的特定基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析免疫組化其基本原理是利用顯色劑標(biāo)記的特異抗體

從上世紀(jì)70年代以來，與DNA、RNA操作相關(guān)的各種分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，到目前已經(jīng)形成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的技術(shù)體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學(xué)研究的重要手段。簡單地說，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技術(shù)。本章主要討論如何對基因進(jìn)行定性、定量分析；在隨后的2章里分別介紹基因功能研究的技術(shù)和基因工程的有關(guān)內(nèi)容。第六章基因分析的基本策略從上世紀(jì)70年代以來，與DNA、RNA操作相關(guān)的1、需要進(jìn)行基因的DNA序列分析:序列測定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術(shù)3、研究基因在基因組中的拷貝數(shù)：SouthernBlot4、研究基因表達(dá)水平：NorthernBlot、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR技術(shù)5、研究基因表達(dá)產(chǎn)物的水平：WesternBlot、流式細(xì)胞儀（FACS）對一個(gè)已知或未知基因的內(nèi)容進(jìn)行研究步驟：1、需要進(jìn)行基因的DNA序列分析:序列測定對一個(gè)已知或未知基第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度對基因和基因組進(jìn)行研究一、DNA序列測定可以揭示基因和基因組一級結(jié)構(gòu)變化DNA測序技術(shù)：

1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法)2、化學(xué)裂解法

3、PCR測序技術(shù)

4、全自動DNA測序儀這些技術(shù)的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度一、DNA序列測

Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。

如果在DNA的合成反應(yīng)中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，T的位置上。對這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測序方法原理Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ基因分析的基本策略基因分析的基本策略基本步驟：1、先將DNA的末端之一標(biāo)記放射性同位素（32P、35S），2、再將DNA樣品分別進(jìn)行多組具堿基特異性、隨機(jī)的、不完全的化學(xué)修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學(xué)試劑在修飾堿基位置斷開DNA鏈；4、通過具有可分辨鏈長短僅一個(gè)核苷酸之差的聚丙烯胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分離開5、根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標(biāo)記片段分布情況，直接讀出DNA序列。化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert）

1977基本步驟：化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert）反應(yīng)體系堿基修飾堿基修飾主鏈斷裂斷裂點(diǎn)試劑反應(yīng)試劑

G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G/AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C/TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C在化學(xué)修飾反應(yīng)中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾，隨后進(jìn)行斷裂反應(yīng)也是定量。反應(yīng)體系堿基修飾堿基修飾5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼（加鹽）5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACDNA自動測序儀上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模DNA測定需要。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點(diǎn)，特別是讀結(jié)果的讀片過程。1987年發(fā)明了一種準(zhǔn)確快速的DNA測序方法，即激光測序法和配套的自動測序儀。（用熒光染料結(jié)合引物）。隨后又發(fā)明了終止標(biāo)記系統(tǒng)法。DNA自動測序儀上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模DNA測定需要。存1、揭示基因和基因組一級結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。2、通過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、通過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、通過DNA序列測定對定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)。

DNA序列測定的意義1、揭示基因和基因組一級結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。D分析基因拷貝數(shù)變化一、Southernblot檢測基因拷貝數(shù)變化Southernblot印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固定支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。

1975年英國愛丁堡大學(xué)的Southern建立了該方法，Southern印跡雜交由此得名。分析基因拷貝數(shù)變化一、Southernblot檢測基因拷Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化水解基因組DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待測DNA樣品的電泳分離。（3）凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段始終保持雙鏈結(jié)構(gòu)。電泳結(jié)束后DNA變性并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)墓潭ㄖС治锷喜拍苓M(jìn)行Southernblot。變性通常用堿變性法。Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提?。?）Southern轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性并將PH恢復(fù)中性后，即可將凝膠中DNA轉(zhuǎn)移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素（NC）膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等。轉(zhuǎn)移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印跡法、真空轉(zhuǎn)移法。（5）已知序列的DNA探針的制備（4）Southern轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性并（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進(jìn)行雜交前，必須先進(jìn)行一個(gè)預(yù)雜交的過程。因?yàn)槟軌蚪Y(jié)合DNA的膜同樣可以和探針DNA結(jié)合，在進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉。（7）雜交結(jié)果的檢測：采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交時(shí)，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經(jīng)沖洗，在X線片上可見黑色條帶。（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探1、對某種生物體基因組拷貝數(shù)研究，需要完整提取出基因組，并需要適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切；2、通常要研究的基因序列是已知的。Southernblot檢測基因拷貝數(shù)注意事項(xiàng)1、對某種生物體基因組拷貝數(shù)研究，需要完整提取出基因組，并需二、采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)原理：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，PCR原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對簡單。PCR反應(yīng)體系：耐熱的TaqDNA聚合酶、化學(xué)合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及合適的緩沖液體系。PCR反應(yīng)的基本過程：變性、退火、延伸二、采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)原理：基因分析的基本策略PCR技術(shù)對擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以一個(gè)恒定的指數(shù)率上升，但經(jīng)過25至30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)量會達(dá)到一個(gè)平臺期，同時(shí)PCR過程中，還會出現(xiàn)“試管效應(yīng)”，因些對不同樣本量的比較無法直接用PCR技術(shù)來鑒定。近年來，隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示PCR和實(shí)時(shí)PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。PCR技術(shù)對擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以

是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)PolyA序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。（1）差異顯示PCR用于基因拷貝數(shù)分析是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端

盡管應(yīng)用

差異顯示PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進(jìn)之中，但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問題：但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問題：(1)重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)；(2)假陽性率可以高達(dá)90%；(3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。盡管應(yīng)用

差異顯示PCR方法已經(jīng)取得了不少成果（2）、代表性差異分析技術(shù)該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合形成的一種方法.主要步驟:1、將對照組(driver)和待測組(tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段群,接上接頭進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增;2、將兩組PCR產(chǎn)物片段群用限制性內(nèi)切酶酶切,形成平均長度256bp的長度.3、將接頭消化,在tester組末端接上新的接頭,tester組和driver組按1:100比例混合.過量的driver可與tester中互補(bǔ)的部分形成雙鏈.4\復(fù)性,按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第2輪PCR，只有tester和tester雜合體才能和引物配對,大量拉增.（2）、代表性差異分析技術(shù)該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合

實(shí)時(shí)PCR根據(jù)PCR反應(yīng)動力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。在PCR反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)體系中的模板的產(chǎn)物深度較低，而引物是過量的，產(chǎn)物和模板復(fù)性不會形成與引物競爭，此時(shí)產(chǎn)物含量呈指數(shù)增加。當(dāng)PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競爭引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物增加減慢，最后進(jìn)入平臺期。所以對樣品中的cDNA進(jìn)行定量分析的最佳時(shí)期是反應(yīng)早期。有人試圖依靠循環(huán)次數(shù)減少來分析樣品中的cDNA含量，但因樣品的差異使之很不可靠。在一定的循環(huán)中，mRNA豐度低的樣品產(chǎn)量少，可能尚不能檢測，豐度高的樣品可能已進(jìn)入平臺期，故難以較。（3）實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析實(shí)時(shí)PCR根據(jù)PCR反應(yīng)動力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的

實(shí)時(shí)PCR原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號的變化計(jì)算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)在寡核苷酸探針的5`端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料，3`端標(biāo)記一個(gè)猝滅染料。當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激活的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當(dāng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切探針成正比，由此可以計(jì)算出PCR產(chǎn)物的含量。實(shí)時(shí)PCR原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入基因分析的基本策略實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。實(shí)時(shí)PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。

核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。原位雜交不需要從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可完整保持組織與細(xì)胞形態(tài)，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理

根據(jù)檢測對象不同可將原位雜交分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交。同時(shí)原位雜交既可檢測DNA，也可檢測RNA，所用探針不同而以。核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，非放射性探針可以用生物素、地高辛、熒光素標(biāo)記探針。根據(jù)檢測對象不同可將原位雜交分為細(xì)胞內(nèi)原（一）、固定：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。（二）、玻片和組織切片的處理：包括玻片處理、細(xì)胞組織切片的處理、降低背景、預(yù)雜交。（三）雜交：調(diào)整探針的濃度（0.5～5.0ng/μl）、探針長度（50～100個(gè)堿基）、雜交的溫度和時(shí)間（四）雜交后處理：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。（五）顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。（六）結(jié)果分析基本方法（一）、固定：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RN

真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最為熱點(diǎn)。它的研究可以提示基因的結(jié)構(gòu)、基因的活性、或基因的變異等。

mRNA研究常用的方法有Northernblot、原位雜交、實(shí)時(shí)PCR、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)、cDNA芯片技術(shù)和RT-PCR。第二節(jié)

利用RNA定性定量分析可從不同角度揭示基因表達(dá)活性真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、Northernblot印跡雜交是指待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固-液相雜交。原理同Southernblot。但因Northernblot印跡雜交法檢測的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時(shí)，所需器皿均需要特殊處理。同時(shí)作為監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)RNA含量不夠準(zhǔn)確，只能作為定性分析RNA方法。（一）Northernblot定性分析RNA的常用方法Northernblot印跡雜交是指待RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴(kuò)增cDNA的技術(shù)。其基本程序是：提取細(xì)胞總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行特定基因的PCR擴(kuò)增。因?yàn)镻CR擴(kuò)增產(chǎn)物有平臺效應(yīng)，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。但如果將陽性參照基因作為內(nèi)參照與待測RNA在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，可以對RNA進(jìn)行相對定量分析。參照基因：β-肌動蛋白（β-actin）、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等。（二）RT-P