磁性納米材料的細胞氧化應激檢測

1、磁性納米材料的細胞氧化應激檢測第1頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五2一、制備磁性Fe3O4納米顆粒的意義： 納米材料是指具有納米量級的超微粒構成的固體物質。納米材料在化學、冶金、電子、航天、生物和醫(yī)學等領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景。運用于生物醫(yī)學領域的納米材料被稱之為納米生物材料。其中磁性納米生物材料具有小尺寸效應、良好的磁導向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基團等特點，可結合各種功能分子，如酶、抗體、細胞、DNA或RNA等，并利用其磁性進行定位、分離和分類，在靶向藥物、酶的固定化、免疫測定、細胞的分離與分類等方面有著廣泛的研究。第2頁，共14頁，2022年，5月20

2、日，10點20分，星期五3小尺寸效應： 小尺寸效應(Small size effect)，當顆粒的尺寸與光波波長、德布羅意波長以及超導態(tài)的相干長度或透射深度等物理特征尺寸相當或更小時，晶體周期性的邊界條件將被破壞，非晶態(tài)納米粒子的顆粒表面層附近的原子密度減少，導致聲、光、電、磁、熱、力學等特性呈現(xiàn)新的物理性質的變化稱為小尺寸效應。對超微顆粒而言，尺寸變小，同時其比表面積亦顯著增加，從而產(chǎn)生如下一系列新奇的性質。小尺寸效應特殊的光學性質特殊的熱學性質特殊的磁學性質特殊的力學性質第3頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五4磁導向性： 人們發(fā)現(xiàn)鴿子、海豚、蝴蝶、蜜蜂以及生活在水中

3、的趨磁細菌等生物體中存在超微的磁性顆粒，使這類生物在地磁場導航下能辨別方向，具有回歸的本領。磁性超微顆粒實質上是一個生物磁羅盤，生活在水中的趨磁細菌依靠它游向營養(yǎng)豐富的水底。通過電子顯微鏡的研究表明，在趨磁細菌體內(nèi)通常含有直徑約為 210-2微米的磁性氧化物顆粒。小尺寸的超微顆粒磁性與大塊材料顯著的不同，大塊的純鐵矯頑力約為 80安米，而當顆粒尺寸減小到 210-2微米以下時，其矯頑力可增加1千倍，若進一步減小其尺寸，大約小于 610-3微米時，其矯頑力反而降低到零，呈現(xiàn)出超順磁性。利用磁性超微顆粒具有高矯頑力的特性，已作成高貯存密度的磁記錄磁粉，大量應用于磁帶、磁盤、磁卡以及磁性鑰匙等。利用

4、超順磁性，人們已將磁性超微顆粒制成用途廣泛的磁性液體。第4頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五5二、實驗目的： 使學生掌握用動物細胞評價生物納米材料生物相容性的方法技術。具體檢測小鼠單核巨噬細胞對磁納米材料的細胞氧化應激。要求學生掌握MTT測定細胞生長的方法、普魯士藍染色法和超薄切片透射電鏡觀察法分析磁性納米顆粒進入細胞的技術，以及檢測細胞氧化應激的一些主要指標及技術。包括（1）分光光度法測定細胞培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶，丙二醛，黃嘌呤氧化酶的含量（2）細胞流式儀測定自由基產(chǎn)生（3）熒光酶標儀測定線粒體損傷。第5頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五6三

5、、實驗原理： 1、普魯士藍染色：原理：鐵離子遇到亞鐵氰根會產(chǎn)生藍色的亞鐵氰化鐵沉淀。2、MTT比色法檢測細胞生長：四挫鹽比色實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法。實驗所用的顯示劑四挫鹽是一種能接受氫原子的燃料，化學名3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮挫溴鹽，商品名是噻挫藍，簡稱為MTT。活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶解的紫藍色結晶物并沉積在活細胞中，而死細胞沒有此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中紫色結晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長測定其吸光值，可間接反映活細胞數(shù)量。第6頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五7 3、超氧化物歧化酶測定

6、SOD對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用。此酶能清楚超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，該試劑采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力?？蓽y實驗用動物的血清（漿）、腦脊液、胸水、腹水、腎透析液、尿液、精液、紅細胞、白細胞、血小板、心肌培養(yǎng)細胞，腫瘤培養(yǎng)細胞，各種動植物細胞，及亞細胞水平中的SOD活力。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化氫胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光光度計測其吸收度。當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸亞減少，比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD

7、活力。第7頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五8四、實驗材料：1.12nm的Fe3O4處理細胞2.小鼠單核巨噬細胞3.普魯士藍染液A4.0.1%核固紅染液配方5.普魯士藍染液B6.4%多聚甲醛配方配方8.固定液配方9.3-（4,5-二甲基噻挫-2）- 2,5-二苯基四氮噻溴鹽，商品名噻挫藍，簡稱MTT10.二甲基亞砜11.超氧化物歧化酶測定試劑盒12.微量丙二醛測定試劑盒13.黃嘌呤氧化酶測定試劑盒14.細胞內(nèi)活性氧水平檢測15.線粒體膜電位檢測試劑盒第8頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五9五、實驗步驟：1. 普魯士藍染色（1）RAW264.7貼壁

8、培養(yǎng)一天，處于對數(shù)生長期；（2）加入不同濃度的納米粒子，一定時間后，光鏡下觀察下觀察納米粒子的攝入情況。（3）PBS洗滌納米粒子干預后的細胞（4）4%多聚甲醛固定10min（5）棄去多聚甲醛，PBS再次洗滌（6）普魯士藍染色（A液和B液等體積混合，靜置5min后即可使用）染色20min（7）棄去普魯士藍染液，PBS再次洗滌（8）核固紅復染10min（9）棄去核固紅染液，PBS再次洗滌（10）顯微鏡下觀察，拍照。第9頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五102. 電鏡檢查方法：（1）胰酶收集納米粒子干預好的細胞（2）PBS清洗一遍（3）PBS和固定液等體積混合的液體清洗一遍，棄上清；（4）加入固定液，沉淀在固定液底部，過夜（5）1%鋨酸再固定1h（6）丙酮梯度脫水（7）Epon-812樹脂包埋（8）半薄切片定位（9）70nm超薄切片（10）醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色（11）JEM-1200透射電鏡觀察第10頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五11六、實驗結果：0-00-500-100第11頁，共14頁，2022年，5月20日，10點20分，星期五120-2