實(shí)驗(yàn)五雞蛋清中卵類粘蛋白分離純化及活性測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)五雞蛋清中卵類粘蛋白分離純化及活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笤O(shè)計(jì)從雞蛋清中分離純化卵類粘蛋白的試驗(yàn)方案。設(shè)計(jì)從雞蛋清中分離純化卵類粘蛋白的試驗(yàn)操作條件。了解離子交換層析系統(tǒng)中四大組成部分和實(shí)驗(yàn)主要影響因素。掌握熟離子交換層析層析儀的使用方法和注意事項(xiàng)。學(xué)會(huì)凝膠預(yù)處理和裝柱、平衡、洗脫的方法。二、器材和試劑1實(shí)驗(yàn)器材：層析系統(tǒng)LH-2，(包括自動(dòng)部分收集器，紫外檢測(cè)儀，記錄儀，蠕動(dòng)泵，梯度混合器)6套；高速離心機(jī)；布氏漏斗；燒杯500ml,100ml，各16個(gè)；移液管1、2、5ml,各16個(gè)；量筒50ml,100ml,各16個(gè)；真空干燥器4個(gè)；滴管，16個(gè)；濾紙$120,1盒；2實(shí)驗(yàn)試劑：丙酮；

2、(2)1%,pHl.15的三氯乙酸：將稱取的三氯乙酸置燒杯內(nèi)，加入2/3總體積的蒸餾水溶解，用6mol/L氯氧化鈉調(diào)至約pHl.15，靜置約1h,然后在pH計(jì)上校正至pH1.15，最后補(bǔ)充水到所配體積；(3)0.02mol/L,pH6.5,磷酸鹽緩沖液；(4)0.5mol/L氯化鈉一05mol/L氫氧化鈉溶液；(5)0.5mol/L鹽酸溶液；(6)0.3mol/L氯化鈉一0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.5；(7)底物緩沖液:0.05mol/L,Tris-HCI緩沖液，pH8.0,內(nèi)含2.22mol/L的氯化鈣；(8)2mmol/1,BAEE底物：用底物緩沖液配制；(9)lmg/mL胰蛋

3、白酶溶液：用0.001mol/L鹽酸配制；(10)DEAE-纖維素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；(12)雞蛋30個(gè)；(13)1%硝酸銀三、實(shí)驗(yàn)原理1蛋清中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成為：卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黃素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制劑、抗生物素蛋白。2.雞卵類粘蛋白(chickenovomucoid,CHOM的性質(zhì)：雞卵類黏蛋白(chickenovomucoid,CHOM是由雞卵清中制得的一種糖蛋白，可強(qiáng)烈地抑制胰蛋白酶,對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用,但對(duì)胰凝乳蛋白酶無(wú)抑制作用,對(duì)人的胰蛋白酶也無(wú)明顯的

4、抑制作用。常用于胰蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。也可將其制成親和吸附劑，通過(guò)親和層析技術(shù)有效地分離與純化胰蛋白酶。雞卵類黏蛋白至今還未能獲得單一組分的制品，目前至少已獲得4種不同組分，它們?cè)谝种埔鹊鞍酌傅男阅苌虾桶被峤M成上差別不大，但是在糖基部分（主要為D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量有差別。由于Ovomucoid所帶的糖基不同，電泳行為呈現(xiàn)出不均一性，其pI大致在3.9-4.5，相對(duì)分子質(zhì)量28000，卵類黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩爾比為1：1。卵類黏蛋白在中性或酸性溶液中對(duì)熱和高濃度的脲都相當(dāng)穩(wěn)定，而在堿性溶液中不穩(wěn)定，尤其是當(dāng)溫度較高時(shí)會(huì)迅速失活。Ovomucoid帶有四種糖基，因

5、此有較強(qiáng)的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸鹽的水溶液中，仍有較好的溶解度。所以，選擇合適的pH,丙酮濃度和三氯乙酸鹽的濃度，可以從蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。Ovomucoid在280nm處的百分消光系數(shù)A1%1cm.280=4.13,即蛋白酶濃度為1mg/ml時(shí),溶液的吸光度A280=0.413,據(jù)此可以測(cè)定其溶液中蛋白質(zhì)的含量。本實(shí)驗(yàn)主要參照Kassell的方法，雞蛋清經(jīng)三氯乙酸（TCA）丙酮溶液處理，除去沉淀物，然后經(jīng)丙酮分級(jí)沉淀獲得粗晶，再用DEAE纖維素柱層析純化而得合格產(chǎn)品。四、實(shí)驗(yàn)步驟1雞卵類黏蛋的提取取50mL雞卵清，加入等體積的10%,PH1.15三氯乙酸溶液（緩緩加入以防

6、局部過(guò)酸出現(xiàn)塊狀物），形成類似于酸奶狀的白色沉淀，輕輕地?cái)嚢杈鶆?。在酸度?jì)上檢查最終pH值應(yīng)為大約3.5,若pH值偏離3.50.2則要用5mol/L氫氫化鈉或5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值，由于提取液非常稠，在調(diào)節(jié)pH值時(shí)防止局部過(guò)酸或過(guò)堿。pH值調(diào)好穩(wěn)定后，在室溫下靜置4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r/min離心10min。棄去沉淀物，上清液用濾紙過(guò)濾，以除去上清液中脂類物質(zhì)及其他不溶物。收集濾液轉(zhuǎn)入500mL的燒杯內(nèi)。檢查濾液的pH值是否為3.5，否則要調(diào)回到pH3.5。置冰浴或冰箱內(nèi)冷卻片刻，緩慢加入3倍體積預(yù)冷的丙酮，用玻璃棒輕輕攪勻，用塑料薄膜蓋好封嚴(yán)，在冰浴里放置24h,

7、待雞卵類黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部轉(zhuǎn)移到50mL帶蓋的離心杯里，加蓋經(jīng)平衡后以3000r/min離心15min,除去上清，沉淀物放在真空干燥器內(nèi)，抽氣除去殘留丙酮。使沉淀物由白轉(zhuǎn)變?yōu)橥该黟こ砦锖笸Ｖ钩闅?。加?0mL蒸餾水溶解，若溶解液混濁則用濾紙濾去不溶物。濾液經(jīng)SephadexG-25柱層析法脫鹽或者經(jīng)透析除鹽。雞卵類黏蛋的脫鹽用SephadexG-25柱層析法脫鹽的操作如下：稱取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol/L,pH6.5的磷酸鹽緩沖液在100c熱溶脹2h或者室溫下溶脹24h。脫氣后裝柱（35mmx300mm,柱床體積約150m

8、L。用約2倍體積的0.02mol/L,pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡。流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線或經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定光吸收，其As小于0.02即可上樣。取20mL雞卵類黏蛋白提取液上柱（上樣量不超過(guò)柱床體積的1/6）。用同樣的緩沖液洗脫，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后鹽才開(kāi)始流出，鹽通常在280nm無(wú)明顯光吸收，若繪出第二峰則是殘留丙酮峰。丙酮和鹽同時(shí)流出。洗脫曲線見(jiàn)下圖。3.012,01.0卵類黏蛋H的純化洗脫！丄樣K/ml逆滬t舟my:，業(yè)蛇工/ml1一宀送我冷庚前：如宀洙脫曲線梳脫截乂為0.02md/Lt沖糠平002mol/L.翻砂縑益神整椎；攏脫戡匸3nl/LN-02mo|

9、/LPH6,5沖液通過(guò)上述方法獲得的雞卵類黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等電點(diǎn)不同，采用DEAE纖維素離子交換層析可以將二者分開(kāi)。稱取10gDEAE-纖維素粉（DE-32），用150mL0.5mol/L氫氧化鈉-0.5mol/L氯化鈉溶液浸泡20min。用布氏漏斗（內(nèi)墊為200目尼龍網(wǎng)）抽濾。用蒸餾水洗至pH8.0左右，抽干。然后移至500mL的燒杯內(nèi)，用150mL0.5mol/L鹽酸溶液浸泡20min,再轉(zhuǎn)移到布氏漏斗內(nèi)，抽濾，用蒸餾水洗至pH6.0左右，最后轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，用150mL0.2mol/L,pH6.5磷酸鹽緩沖液浸泡約15min,經(jīng)真空干燥器脫氣后裝柱。取一支層析柱（3

10、5mmx200mm裝入約1/4體積的0.02mol/L,pH6.5磷酸鹽緩沖液，將處理過(guò)的DEAE纖維素裝入柱內(nèi)。以同一緩沖液平衡，流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線或經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定光吸收，待A28o值小于0.02即可加樣。將經(jīng)SephadexG-25脫鹽后的雞卵類黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol/L,pH6.5的磷酸鹽緩沖液平衡，基線穩(wěn)定后，改用03mol/L氯化鈉0.2mol/L,pH6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集第二洗脫峰。柱層析圖譜見(jiàn)上圖。在雞卵類黏蛋白液中所含的雞卵清清蛋白，在洗脫時(shí)可能出現(xiàn)一個(gè)小峰或不明顯的峰形。在這種情況下可根據(jù)峰形大小，測(cè)定活性來(lái)確定雞卵類黏蛋白

11、洗脫峰的位置。4.雞卵類黏蛋白純品的制備經(jīng)DEAE纖維素離子交換柱層析制得的雞卵類黏蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，用蒸餾水進(jìn)行透析，間隔一段時(shí)間更換一次蒸餾水，直至經(jīng)1硝酸銀檢查無(wú)氯離子為止。將透析過(guò)的雞卵類黏蛋白溶液轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，小心地用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.0,取出ImL,稀釋510倍測(cè)定雞卵類黏蛋白的含量及活性。然后加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，用塑料薄膜封嚴(yán)燒杯口,在冰浴里靜置4h左右。待雞卵類黏蛋白完全析出后，傾去上清，沉淀轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶蓋的50mL離心杯內(nèi)，于3000r/min離心15min,棄上清，沉淀物放人真空干燥器內(nèi)干燥，即可得到透明膠狀物-雞卵類黏蛋白（約200300mg）。5雞卵

12、類黏蛋白的含量測(cè)定配成一定濃度的雞卵類黏蛋白溶液，測(cè)定A280。雞卵類黏蛋白的消光系數(shù)是：Ai%cm=4.13。雞卵類黏蛋白（mg/mL）=（A28X稀釋倍數(shù)）/0.4136.雞卵類黏蛋白的活性測(cè)定（選做）雞卵類黏蛋白的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力單位表示。即：抑制1個(gè)胰蛋白酶活力單位（BAEE單位）所需卵類黏蛋白量定為抑制劑的1個(gè)活力單位。取2個(gè)石英比色池（帶蓋,光程為Icm）,一個(gè)加入0.05moI/L,pH80Tris-HCI緩沖液和2.0mol/L,BAEE底物溶液各1.5mL混勻，在波長(zhǎng)253nm處調(diào)整儀器零點(diǎn)。另一個(gè)比色池內(nèi)加0.05mol/L,pH8.0,Tris-HCI緩沖液1

13、.5mL,10卩L胰蛋白酶液（約10卩g胰蛋白酶），10卩L雞卵類黏蛋白（約5-101g雞卵類黏蛋白）輕輕搖勻，在室溫下（最好是在25C恒溫箱內(nèi)）放置2min.如蛋白酶與雞卵類黏蛋白充分結(jié)合。然后加入2mol/LBAEE底物溶液15mL,立即混勻并記時(shí)。于波長(zhǎng)253mn處測(cè)定其光吸收遞增值A(chǔ)253/min。每隔30s讀數(shù)一次，使A253/min值控制在0.05左右為宜，否則要根據(jù)A253/min的大小適當(dāng)減少或增加雞卵類黏蛋白的量。以反應(yīng)時(shí)間t為橫坐標(biāo)，a253為縱坐標(biāo)作圖，取直線部分的任一時(shí)間間隔與相應(yīng)的光吸收變化值為A253/min用A表示。與此同時(shí)，以同樣的方法（不加雞卵類黏蛋白：測(cè)胰蛋白酶的活性。通過(guò)作圖得到光吸收變化值A(chǔ)253/min,用A表示。雞卵類黏蛋白的抑制活性及抑制比活性的計(jì)算公式如下：雞卵類黏蛋白的抑制活性單位（BAEE）=（Al-A2）/0.001雞卵類黏蛋白抑制比活單位（BAEE單位/mg胰蛋白酶）=（AI-A2）X1000/（AI-A2）/1X0.001式中Ai:胰蛋白酶A253/min；A2：加入抑制劑后