蛋白質(zhì)的分離與純化(共12頁(yè))

1、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與純化一，蛋白質(zhì)的提取(tq)大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)(shosh)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操

2、作。為了避免蛋白質(zhì)提以過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采

3、用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及 HYPERLINK /forum-71-1.html t _blank

4、微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋

5、白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶

6、液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。2、等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶

7、解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過(guò)濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱

8、中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。1、電泳法各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。2、離子交換層析法離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖

9、維素；DEAE?FONT FACE=宋體 LANG=ZH-CN纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。（詳見層析技術(shù)章）（四）根據(jù)配體特異性的分離方法親和色譜法親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形

10、式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是 HYPERLINK /forum-2-1.html t _blank 生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。細(xì)胞的破碎1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入

11、研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉

12、等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。濃縮、干燥及保存一、樣品的濃縮生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過(guò)降低液面壓力使液體

13、沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮 空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過(guò)空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過(guò)(tu u)膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。3、冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中，操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集

14、中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。4、吸收法 通過(guò)吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法，不液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^(guò)膜時(shí)，溶劑和小分子透過(guò)，大分子受阻保留，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法，最適于生

15、物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來(lái)選用。另外，超濾裝置形式，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對(duì)超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動(dòng)。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當(dāng)緩沖液流過(guò)纖維管時(shí)，則小分子很易透過(guò)膜而擴(kuò)散，大分子則不能。這就是纖維過(guò)

16、濾秀析法，由于透析面積增大，因而使透析時(shí)間縮短10倍。二、干燥生物大分子制備得到產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的干燥保存。三、貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低

17、溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持04度冰箱即可，液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。2、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對(duì)某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。3、貯藏溫度要求低，大多數(shù)在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應(yīng)視不同物質(zhì)而定?？梢罁?jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)與之相對(duì)

18、應(yīng)的方法將蛋白質(zhì)混合物分離：1分子大小不同種類的蛋白質(zhì)在分子大小方面有一定的差別，可用一些簡(jiǎn)便的方法，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。11透析和超濾透析在純化中極為常用，可除去鹽類（脫鹽及置換緩沖液）、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子量為5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危險(xiǎn)，在純化中極為常用，可除去鹽類、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色12離心分離置換緩沖液許多酶富集于某一細(xì)胞器內(nèi)，勻漿后離心得得到某一亞細(xì)胞成分，使酶富集1020倍，再對(duì)特定的酶進(jìn)行純化。差速離心，分辨率較低，僅適用于粗提或濃縮。速率區(qū)帶法，如離心時(shí)間太長(zhǎng)所有的物質(zhì)都會(huì)沉淀下來(lái)

19、，故需選擇最佳分離時(shí)間，可得到相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分用于進(jìn)一步純化，避免了差速離心中大小組分一起沉淀的問(wèn)題，但容量較小，只能用于少量制備。等密度梯度離心常用的離主介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、碘化鈉等等13凝膠過(guò)濾這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一，注意使要離的蛋白質(zhì)分子量落在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。2形狀蛋白質(zhì)在離心通過(guò)溶液運(yùn)動(dòng)時(shí)，或通過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到形狀的影響：對(duì)兩種相同質(zhì)量的蛋白質(zhì)而言，球狀蛋白質(zhì)具有較小的有效半徑（斯托克半徑），通過(guò)溶液沉降時(shí)遇到的摩擦力小，沉降較快而

20、顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)大；反之，在體積排阻色譜時(shí)，斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散進(jìn)入凝膠過(guò)濾填料顆粒內(nèi)部，較遲洗脫出來(lái)，因而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)要小。3溶解度利用蛋白質(zhì)的溶解度的差別來(lái)分別各種蛋白質(zhì)常用的方法。影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度，但在同一的特定外界條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)(shdng)改變外界條件，控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度31pH控制和等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)一般較不易溶解。32蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析33有機(jī)溶劑分級(jí)法蛋白質(zhì)在不同的溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（10g/ml）直至極易溶解（3

21、00mg/ml）不等。影響蛋白質(zhì)溶解度的可變因素包括溫度、pH、溶劑的極性、離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，故控制有機(jī)溶劑的濃度可分離蛋白質(zhì)。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)的沉淀。34溫度不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，故分離操作一般在0或更低溫度下進(jìn)行(jnxng)。4電荷蛋白質(zhì)凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負(fù)電荷的總和，如中性溶液中帶凈負(fù)電荷則稱為酸性蛋白質(zhì)，41電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要手段，而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的方法。等電聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差異就能分開。2D

22、分離蛋白質(zhì)分辨率已經(jīng)發(fā)展到100000個(gè)蛋白點(diǎn)。42離子交換層析改變蛋白質(zhì)混合物溶液中的鹽離子強(qiáng)度、pH和（陰、陽(yáng)）離子交換填料，不同蛋白質(zhì)對(duì)不同的離子交換填料的吸附容量不同，蛋白質(zhì)因吸附容量不同或不被吸附而分離。洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變，也可采用改變洗脫劑的鹽度或pH的方法洗脫，后一種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑，多用梯度洗脫?？刂葡疵搫┑捏w積（與柱床體體積相比）、鹽濃度和pH，樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來(lái)。蛋白分子暴露在外表面的側(cè)鏈基團(tuán)的種類和數(shù)量不同，故在一定的PH值和離子強(qiáng)度的緩沖液的所帶的電荷不同

23、5電荷分布電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質(zhì)的表面，既可以適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度與陽(yáng)離子交換柱結(jié)合也能以適當(dāng)強(qiáng)度與陰離子結(jié)合，因多數(shù)蛋白質(zhì)都有不能在單一的溶劑條件下同時(shí)與兩種類型的離子交換柱結(jié)合，故可得用此性質(zhì)純化；電荷的氨基酸殘基亦可成簇分布，使某一區(qū)域帶強(qiáng)正電荷而另一區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷，呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性，只能在極端pH與陽(yáng)離子交換樹脂或陰離子交換樹脂結(jié)合，如鈣調(diào)蛋白只能在pH2時(shí)與陽(yáng)離子交換樹脂結(jié)合。6疏水性多數(shù)疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，但也有一些在表面。蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合從而利用它來(lái)進(jìn)行分離的能力。因其廉價(jià)和純化后的蛋白質(zhì)具有生

24、物活性，是一種通用性的分離和純化蛋白質(zhì)的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質(zhì)在柱上保留，在低鹽或水溶液中蛋白質(zhì)從柱上被洗脫，故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上，當(dāng)然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌的治療蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上，在分離的同時(shí)也進(jìn)行了復(fù)性。7密度多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.31.4g/cm3之間，分級(jí)分離蛋白質(zhì)時(shí)一般不常用此性質(zhì)，不過(guò)對(duì)含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)與一般蛋白質(zhì)在密度上明顯不同，可用密度梯度法離心與大部分蛋白質(zhì)分離。8基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記通過(guò)改變 cDNA在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個(gè)額外

25、氨基酸，這個(gè)加入的標(biāo)記可用來(lái)作為一個(gè)有效的純化依據(jù)。81GST融合載體使要表達(dá)的蛋白質(zhì)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。82蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose純化。83含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）Chelating Sepharose最通行的標(biāo)記之一，是在蛋白質(zhì)的氨基端加上610個(gè)組氨酸，在一般或變性條件（如8M尿素）下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，用咪唑洗脫，或?qū)H降至5.9使組氨酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2

26、+使之得以純化。重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或可溶產(chǎn)物，擴(kuò)張床吸附技術(shù)STREAMLINE適合做粗分離。9親和能力結(jié)合效率高，分離速度快的特點(diǎn)。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體、吸附后可改變緩沖液的離子強(qiáng)度和PH的方法，洗耳恭聽脫下來(lái)，也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫親和層析固定相的配基與生物分子之間的特殊的生物大分子親和能力不同來(lái)進(jìn)行相互分離的，依親和選擇性的高低分為：基團(tuán)性親和層析，固定相上的配基對(duì)一類基團(tuán)的極強(qiáng)的親和力。如含有糖基的一類蛋白質(zhì)或糖蛋白對(duì)三嗪染料顯示特別強(qiáng)的吸附能力；高選擇性（專一性）親和層析，配基僅對(duì)某一種

27、蛋白質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性。如單克隆抗體對(duì)抗原的特異性的吸附。親和層析除特異性的吸附外，仍然會(huì)因分子的錯(cuò)誤認(rèn)別和分子間非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質(zhì)，另洗脫過(guò)程中的配體不可避免的脫落進(jìn)入分離體系。與超濾結(jié)合起來(lái)，將兩者優(yōu)點(diǎn)集中形成超濾親和純化，具有高分離效率和大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，適用于初分離。按配基的不同可分為：（1）金屬螯合介質(zhì)過(guò)渡金屬離子Cu2、Zn2和Ni 2等以亞胺絡(luò)合物的形式鍵合到因定相上，由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價(jià)鍵，從而形成了亞胺金屬蛋白螯合物，使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性受單個(gè)組氨酸和半胱氨酸解離常數(shù)所控

28、制，從而亦受流動(dòng)相的pH和溫度的影響，控制條件可以使不同蛋白質(zhì)相互分離。（2）小配體親和介質(zhì)配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、明膠、肝素和賴氨酸等等。（3）抗體親和介質(zhì)即免疫親和層析，配體有重組蛋白A和重組蛋白G，但蛋白A比蛋白G專一，蛋白G能結(jié)合更多不同源的IgG。（4）顏料親和介質(zhì)染料層析的效果除主要取決于染料配基與酶的親和力大小外，還與洗脫緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、PH值及待分離的樣品的純度有關(guān)。配體有Cibacron Blue和Procion Red兩種。在一定的條件下，固定化的染料能起陽(yáng)離子交換劑的作用，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，最好要離子強(qiáng)度小于0。1和PH大于7時(shí)操作。（5）外源凝集素

29、親和介質(zhì)配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素，固相外源凝集素能和數(shù)種糖類殘基發(fā)生可逆反應(yīng)，適合純化多糖、糖蛋白。10非極性基團(tuán)之間作用力溶質(zhì)分子中的非極性基團(tuán)與非極性固定相間的相互作用力（非選擇性分散力或倫敦力）大小與溶質(zhì)分子極性基團(tuán)與流動(dòng)力相中極性分子在相反方向上相互作用力的差異進(jìn)行分離。因其流動(dòng)相中的置換劑是極性小于水的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃等），這些有機(jī)溶劑可能使許多蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不可逆的變性；流動(dòng)相中須有離子對(duì)試劑（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分離有效地進(jìn)行和獲得高的質(zhì)量回收率；分離須在酸性介質(zhì)中進(jìn)行（一般pH在23之間），又有一些蛋白質(zhì)會(huì)在后兩種條件下產(chǎn)

30、生不可逆的分子構(gòu)象變化，故在生物大分子中人分離純化中受到限制，但分子構(gòu)象變化可逆的蛋白質(zhì)而言是有效的方法。正相色譜在生物大分子中的分離和純化中應(yīng)用相對(duì)較少，因所用的溶劑很貴。11可逆性締合在某些溶液條件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下則形成單體，如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進(jìn)行分級(jí)分離。12穩(wěn)定性121熱穩(wěn)定性大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到95時(shí)會(huì)解折疊或沉淀，利用這一性質(zhì)，可容易地將一種經(jīng)這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大部分其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中分離開。122蛋白酶解穩(wěn)定性用蛋白酶處理上清液，消化雜蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白質(zhì)。13分配系數(shù)即利用雙水相萃取分離，常用的

31、生物物質(zhì)分離體系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。由于具有含水比例高、選用的聚合物及鹽對(duì)酶無(wú)毒性、分離設(shè)備與化學(xué)工業(yè)通用等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上目益受重視。分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無(wú)機(jī)鹽種類等因素影響，發(fā)展：具有親和雙水相萃取及膜分離雙水相萃取等新型雙水相分離技術(shù)。雙向水溶液系統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化一些與水混合多聚物的不相溶性導(dǎo)致依賴于多聚物濃度的兩相系統(tǒng)的液-液分配技術(shù)，可以由兩不同的高水溶性的多聚物或一種多聚物各一種鹽，用于從微生物勻漿中除支細(xì)胞碎片、后續(xù)分配步驟進(jìn)一步純化。分離的選擇性一般隨著分離分子或顆粒大小面增加。14表面活性141

32、泡沫分離蛋白質(zhì)溶液具有表面活性，氣體在溶液中鼓泡，氣泡與液相主體分離，在塔頂富集，達(dá)到分離和濃縮的目的。142反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法是80年代興起的一種新型分離技術(shù)，它利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反向膠團(tuán)（反膠團(tuán)），在一定條件下將水溶性蛋白質(zhì)分子增溶進(jìn)反膠團(tuán)的極性核（水池）中，再創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)抽提至另一水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移，達(dá)到分離和提純蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)中的蛋白質(zhì)分子受到周圍水分子和表面活性劑極性頭的保護(hù)，仍保持一定的活性，甚至表現(xiàn)出超活性。由于蛋白質(zhì)增溶于反膠團(tuán)與蛋白質(zhì)所帶電荷及反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷間的靜電作用及反膠團(tuán)的大小有關(guān)，因而表面活性劑的種類、水溶液的pH值及

33、離子強(qiáng)度等因素均影響反膠團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道利用AOT異辛烷反膠團(tuán)對(duì)酵母脂肪酶進(jìn)行相轉(zhuǎn)移。143聚合物-鹽-水液-固苯取體系是90年代在國(guó)內(nèi)開發(fā)的種新的萃取體系，成功地用于萃取金屬離子及卞果酸脫氫酶等生物活性物質(zhì)較強(qiáng)的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接傾出液相即可使液固的相分離，勿需特殊技術(shù)處理，不用有機(jī)溶劑，無(wú)毒性，成相聚合物及鹽對(duì)生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定和保護(hù)作用，萃取分離選擇性好消耗低、易于規(guī)模放大的分離生隊(duì)物活件物質(zhì)的新技術(shù)在聚乙二醇修飾物的聚乙二醇葡聚糖雙水相萃取體系共價(jià)作用：主要用于含巰基酶的純化，通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在層析介質(zhì)上，偶聯(lián)是可逆的，能還原二硫鍵的低分子化合物洗脫，如空

34、間位阻，可在含變性劑的緩沖液時(shí)吸附，如已含二硫鍵，則先用還原劑打開。（一）雙縮脲測(cè)定法1原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強(qiáng)，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測(cè)出毫克水平。2試劑配制硫酸銅（CuSO45H2O） 1.50g酒石酸鉀鈉 5.00gH2O 500.0ml10氫氧化鈉（不含硫酸鈉） 300mlH2O 加至 1 000ml此溶液可長(zhǎng)期保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時(shí)須首先采用凱氏定氮法測(cè)定牛血清白

35、蛋白制品中實(shí)際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1的濃度。 混勻后于室溫放置0.5h1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測(cè)3次，求其平均值。 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4樣品測(cè)定 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做110稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h1h。 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對(duì)照。 測(cè)OD540值。 根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時(shí)間均有差異，一旦標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后，樣品的測(cè)定則必須與標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的條

36、件一致，否則結(jié)果有差異。（二）紫外光譜吸收法1原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸在紫外光區(qū)的吸收特點(diǎn)而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測(cè)到微克水平，操作簡(jiǎn)單，不需要加各種試劑，測(cè)完后，樣品可回收。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg0.9mg，以鹽水對(duì)照。 測(cè)各管OD280值。 以O(shè)D280值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3樣品測(cè)定將待測(cè)樣品以鹽水適當(dāng)稀釋，在0.10mg/ml1.00m

37、g/ml之間，以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)OD280值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。（三）Folin酚法1原理 蛋白質(zhì)中的酪氨酸與色氨酸和Folin酚試劑中的磷鎢酸、磷鉬酸作用后，在堿性條件下不穩(wěn)定，被還原成藍(lán)色的化合物（鉬藍(lán)）。因此通過(guò)比色即可測(cè)知標(biāo)本中的蛋白含量。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，且不受溶液中脂多糖的干擾。2試劑試劑甲：A液：Na2CO3 10.00gNaOH 2.00g酒石酸鉀鈉（或鉀鹽鈉鹽）0.25g混合、溶于500ml蒸餾水中。B液：CuSO45H2O 0.5gH2O 100.00ml用前將A液50份與B液1份混合即為試劑甲。試劑乙：于磨口回流瓶加入下列試劑Na2WO42H2O

38、100.00gNaMoO42H2O 25.00gH2O 700.00ml85H3PO4 50.00ml濃HCl 100.00ml按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：硫酸鋰 150.00gH2O 50.00ml溴水 數(shù)滴開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色微帶綠色（如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴步驟）。稀釋至1L，過(guò)濾，濾液置于棕色瓶保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH液滴定，以酚酞為指示劑，然后適當(dāng)稀釋（加水約1倍）使最終濃度為1mol/L。3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸餾水中，使成250g/ml。 按表8-2稀釋。 每管加試劑甲5ml，混合后室溫放置10min，再加0.50ml試劑乙（即Folin酚試劑），立即搖勻（否則顯色降低）。 30min后測(cè)OD650nm。 以O(shè)D為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線