絲狀真菌基因工程

1、絲狀真菌(zhnjn)基因工程1共十六頁真菌(zhnjn)包括霉菌（絲狀真菌(zhnjn)）、酵母菌和蕈菌三個類群。由于真菌(zhnjn)兼具微生物遺傳學(xué)特征和動植物分子學(xué)機(jī)制，因此以真菌(zhnjn)為受體細(xì)胞的基因工程具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。共十六頁5.1絲狀真菌(zhnjn)基因工程絲狀真菌某些種屬的優(yōu)勢特征：1.表達(dá)分泌大量蛋白質(zhì)2.長期安全的用于生產(chǎn)酶和抗生素3.發(fā)酵(f jio)過程成本低廉且可操作性強(qiáng)共十六頁5.1.1絲狀真菌(zhnjn)的載體克隆系統(tǒng)1.選擇性標(biāo)記基因2.整合序列或復(fù)制子結(jié)構(gòu)3.一些表達(dá)型質(zhì)粒還含有性能優(yōu)良(yuling)的絲狀真菌 表達(dá)調(diào)控元件共十六頁

2、5.1.1.1質(zhì)粒載體(zit)上的選擇性標(biāo)記標(biāo)記來源選擇系統(tǒng)（基因產(chǎn)物）營養(yǎng)缺陷型arg +A.nidulans精氨酸原養(yǎng)性（鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶）pyr I +（pyr G +）N.crassa尿嘧啶原養(yǎng)性（乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶）抗藥性HygB +E.coli潮霉素B抗性（潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶）Neo rE.coliG418抗性（G418磷酸轉(zhuǎn)移酶）Bleo rE.coli博來霉素抗性（博萊霉素結(jié)合蛋白）功能產(chǎn)物amdS +A.nidulans乙酰胺利用（乙酰胺酶）其他LacZ +E.coli顏色選擇（孢子）（-半乳糖苷酶）共十六頁5.1.1.2絲狀真菌(zhnjn)載體質(zhì)粒的構(gòu)建1.整合

3、型質(zhì)粒2.自主復(fù)制(fzh)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化各種絲狀真菌均能獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，絕大多數(shù)供體DNA片段均整合在受體菌染色體DNA的同源位點外側(cè)。但轉(zhuǎn)化頻率相當(dāng)?shù)?，一般只?0-20轉(zhuǎn)化子/g DNA。在在絲狀真菌中較不穩(wěn)定，其轉(zhuǎn)化僅在少數(shù)受體系統(tǒng)中獲得成功，主要原因是絲狀真菌的多核生長狀態(tài)強(qiáng)烈抑自主復(fù)制型質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的等量分配。構(gòu)建自主復(fù)制系統(tǒng)的關(guān)鍵是尋找絲狀真菌的ARS 序列。ARS序列有利于質(zhì)粒的自主復(fù)制和提高其在宿主菌中的穩(wěn)定性。共十六頁5.1.1.3絲狀真菌基因的克隆(k ln)操作總DNA的提取(tq)方法：1.新鮮菌絲體，液氮冷凍，研碎2.加入500lTES緩沖液懸浮3.余500lTE

4、S飽和的苯酚混合均勻，離心4.水相用苯酚和氯仿萃取一次5.萃取液用乙醇沉淀6.沉淀用250lTE緩沖液懸浮7.加入2.5lRNaseA（10mg/ml），37保溫1h8.用苯酚萃取一次，氯仿萃取兩次9.在水相中加入150l 5 mol/L的NaCl 和400l的 PEG6000，冰浴1h，離心共十六頁5.1.1.3絲狀真菌基因(jyn)的克隆操作分離克隆基因主要的方法：1.突變遺傳(ychun)互補(bǔ)法2.隨機(jī)整合法3.cDNA差示克隆法4.染色體走讀法共十六頁5.1.2絲狀真菌的宿主(szh)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法：1.CaCl2/PEG誘導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法2.脂質(zhì)體介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法3.電穿孔法

5、4.醋酸鋰介導(dǎo)的完整(wnzhng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率和方法取決于質(zhì)粒的性質(zhì)。共十六頁FDA批準(zhǔn)的基因工程安全受體菌（GRAS）:硫曲霉菌和黑曲霉菌構(gòu)建絕對安全有效的宿主轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括兩方面的工作：1.切除與毒素(d s)生物合成有關(guān)的基因，徹底杜絕受體菌基因突變重新合成毒素的可能性；2.構(gòu)建位點特異性整合的載體系統(tǒng)，阻止轉(zhuǎn)化質(zhì)粒由于隨機(jī)重組整合而對絲狀真菌受體菌基因組造成的任何獲得性或缺陷性基因突變現(xiàn)象的發(fā)生。共十六頁5.1.3絲狀真菌(zhnjn)的表達(dá)分泌系統(tǒng)5.1.3.1基因的表達(dá)(biod)調(diào)控原件絲狀真菌中DNA順式元件的排列方式共十六頁5.1.3.2蛋白質(zhì)的加工(ji gng)與分

6、泌 蛋白質(zhì)的成熟與分泌與其在細(xì)胞內(nèi)的正確折疊密切相關(guān)，二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和肽基脯酰胺順反異構(gòu)酶（PPIase）對于蛋白質(zhì)的折疊十分重要。 許多信號肽序列可在絲狀真菌(zhnjn)中發(fā)揮作用，一般不需要將異源基因與絲狀真菌(zhnjn)信號肽序列融合。但也有例子證明信號肽序列對分泌有影響。 糖基化修飾反應(yīng)是異源蛋白質(zhì)加工的一個重要內(nèi)容。共十六頁5.1.3.3蛋白酶系統(tǒng)(xtng)絲狀真菌能產(chǎn)生和分泌幾乎所有已知的蛋白酶家族，其中內(nèi)切肽酶的含量最為豐富。蛋白酶的降級作用是異源蛋白產(chǎn)量較低的主要原因。利用基因(jyn)同源交換技術(shù)或紫外誘變技術(shù)滅活產(chǎn)量較大的蛋白酶基因，可從根本上解決異源蛋白的降

7、解作用。共十六頁5.1.4重組曲霉菌在重組異源蛋白(dnbi)生產(chǎn)中的應(yīng)用重組(zhn z)凝乳酶的生產(chǎn)重組白細(xì)胞介素的分泌表達(dá)重組磷脂酶A2的生產(chǎn)共十六頁5.1.5-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)(shngchn)菌的改良 自弗萊明1928年發(fā)現(xiàn)青霉素以來，篩選優(yōu)良生產(chǎn)(shngchn)菌株的工作全面展開。DNA重組技術(shù)也運(yùn)用到生產(chǎn)菌的改良。改良抗生素生產(chǎn)菌的三種戰(zhàn)略1.解除抗生素生物合成途徑中限速步驟對最終產(chǎn)物的影響。2.構(gòu)建具有不同生物代謝途徑的工程菌。3.利用已克隆的生物合成基因構(gòu)建抗生素高產(chǎn)工程菌。共十六頁內(nèi)容摘要絲狀真菌基因工程。尿嘧啶原養(yǎng)性（乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶）。轉(zhuǎn)化各種絲狀真菌均能獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，絕大多數(shù)供體DNA片段均整合在受體菌染色體DNA的同源位點外側(cè)。但轉(zhuǎn)化頻率相當(dāng)?shù)?，一般只?0-20轉(zhuǎn)化子/g DNA。構(gòu)建(u jin)自主復(fù)制系統(tǒng)的關(guān)鍵是尋找絲狀真菌的ARS 序列。ARS序列有利于質(zhì)粒的自主復(fù)制和提高其在宿主菌中的穩(wěn)定性。8.用苯酚萃取一次，氯仿萃取兩次。硫曲霉