小麥花藥培養(yǎng)后代和雜交后代中高分子量麥谷蛋白亞基變異分析

1、小麥花藥培養(yǎng)后代和雜交后代中高分子量麥谷蛋白亞基變異分析韓曉峰1,2，葉興國1,，劉曉蕾1,3，魏亦勤4，杜麗璞1，王 軻2，佘茂云1，樊 明4，晏月明2,（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家基因資源與基因改良重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048； 3 北方民族大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，銀川 750021；4寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，永寧 750105）摘要：通過對Alondra、Orofen等5個小麥品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，同時以新春9號、京771、CB037等9個高分子量麥谷蛋白亞基組成不同的小麥品種相互間配制24個

2、正、反交組合，分析小麥加倍單倍體無性系和品種間雜交后代中高分子量麥谷蛋白亞基（High molecular weight glutenin subunits, HMW-GS）變異，探討利用花藥培養(yǎng)和雜交手段改良HMW-GS組成的可能性。SDS電泳分析發(fā)現(xiàn)，小麥加倍單倍體無性系中HMW-GS發(fā)生了頻繁變異，Alondra加倍單倍體中變異率最高（61.8%），Verry加倍單倍體次之（16.7%），均出現(xiàn)了原始材料中所不具備的亞基類型；HMW-GS在部分F1雜種中呈現(xiàn)不完全共顯性、亞基表達(dá)沉默和正、反交亞基表達(dá)不一致現(xiàn)象，寧春4號/CB037、京771/寧春4號2個組合中出現(xiàn)了雙親所不含有的亞基；

3、通過連續(xù)自交和對新出現(xiàn)亞基的跟蹤選擇，獲得了表達(dá)新亞基的高代株系。研究結(jié)果對于改良小麥加工品質(zhì)，加深了解小麥HMW-GS編碼基因的遺傳特性、結(jié)構(gòu)特性等具有一定理論意義和實(shí)踐價值。關(guān)鍵字：小麥；高分子量麥谷蛋白亞基；花藥培養(yǎng)；無性系變異；SDSComposition Variation of High Molecular Weight Glutenin Subunits in the Doubling Haploids from Anther Culture and the Crossing Hybrids in WheatHAN Xiao-fen1,2, YE Xing-guo1, LIU X

4、iao-lei1,3, WEI Yi-qin4, DU Li-pu1, WANG ke2, SHE Mao-yun1, FAN Ming4, and YAN Yue-ming2(1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048; 3 College of Life Sciences and Biology Engineering,

5、North University for Ethnics, Yinchuan, Ninxia 750021；4 Crop Research Institute, Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Yongning, Ningxia 750105)Abstract: High molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) in the doubling haploids from five stable cultivars and in the twenty-four cross

6、ing hybrids between ninet different varieties in common wheat were analyzed by SDSto explore the possibility of improving the subunit compositions by anther culture and commercial crossing. The results f indicated that frequent variation of HMW-GS happened in the doubled haploids with a rate up to 6

7、1.8% in the genotypes tested, and several subunits might be new ones which are not present in the corresponding wild types, but need to be identified further. In most F1 hybrids, the expression of all HMW-GS appeared to be co-dominant, but the expression of one or two HMW-GSs was did found to be sup

8、pressed in a few F1 crosses. Cytoplasm of female parents was found to have some effect on the expression of very few subunit in a few crosses. At the same time, 2-3 possible new subunits that did not exist in the parents were observed in the two crosses, Ningchun4/CB037 and Jing771/Ningchun4. By con

9、tinuous self-crossing and tracing of the new subunits, stable lines expressing the putative new subunits were obtained from the two crosses mentioned above. The present study is theoretical and practical valuable for the improvement of wheat quality and the further understanding of the genetic and s

10、tructural features of HMW-GSs encoding genes.Key words: Triticum aestivum; High molecular weight glutenin subunits; Anther culture; Somatic variation; SDS收稿日期：2010-05-14 修回日期：2010-07-28基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30830072)；寧夏農(nóng)業(yè)廳重點(diǎn)合作項(xiàng)目資助作者簡介：韓曉峰，碩士研究生。E-mail： HYPERLINK mailto: 通訊作者：晏月明，博士，教授。E-mail： HYPERLINK mail

11、to:yanym yanym；葉興國，博士，研究員。E-mail： HYPERLINK mailto:yexg yexg麥谷蛋白（Glutenin）是小麥儲藏蛋白的主要組成成分，包括高分子量麥谷蛋白亞基(High molecular weight glutenin subunits, HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(Low molecular weight glutenin subunits, LMW-GS)二類，約占子粒蛋白的35%45%1-3。高分子量麥谷蛋白亞基由Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1三個位點(diǎn)編碼，分別位于1AL、1BL、1DL染色體上4-7；低分子量麥谷蛋白亞基

12、由Glu-A3、Glu-B3、Glu-D3三個位點(diǎn)編碼，分別位于1AS、1BS、1DS染色體上6-8。高分子量麥谷蛋白亞基等位基因變異主要影響面筋強(qiáng)度，后者關(guān)系到面包和面條的加工品質(zhì)及商業(yè)價值9-13。研究表明，HMW-GS由復(fù)等位基因控制，每個染色體上的2個基因緊密連鎖，如同一個孟德爾遺傳單位4，13。常規(guī)雜交能使HMW-GS編碼基因聚合在同一基因組中，HMW-GS基因在F1代表達(dá)存在劑量效應(yīng)，即雙親的全部亞基呈共顯性遺傳，在F2代的遺傳符合孟德爾獨(dú)立分配及自由組合規(guī)律，并帶有母性遺傳現(xiàn)象15-16。并且，Glu-1位點(diǎn)的復(fù)等位基因在F1代子粒中兩兩共同存在時，無正反交區(qū)別，也無顯隱性可言1

13、7。組織培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)基中化學(xué)成分的作用，可誘發(fā)培養(yǎng)物中激活子、解離子的活性，從而產(chǎn)生基因變異，以及染色體結(jié)構(gòu)變異18。胡含等發(fā)現(xiàn)小麥花粉植株在形態(tài)上及染色體數(shù)目上存在變異，初步解釋了小麥花粉無性系變異具有普遍性的原因19。本課題組90年代利用花藥培養(yǎng)技術(shù)對幾個定型品種進(jìn)行了無性系誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)了加倍單倍體在株高、穗長、粒重等農(nóng)藝性狀上存在變異20。目前，還沒有在小麥雜交后代中發(fā)現(xiàn)超越雙親HMW-GS亞基組成及正、反雜交組合中HMW-GS亞基組成不同的現(xiàn)象，也沒有關(guān)于花藥培養(yǎng)后代中HMW-GS亞基組成發(fā)生變異的報道。為此，我們對Alondra、Orofen、Verry等小麥品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，培

14、育出足夠數(shù)量的加倍單倍體，采用SDS對加倍單倍體進(jìn)行電泳分析；利用新春9號、京771、CB037、中國春、寧春4號、Bobwhite、揚(yáng)麥12號、京冬8號等HMW-GS亞基組成不同的小麥品種相互間配制正交和反交組合，利用SDS對雜交當(dāng)代子粒及后代子粒HMW-GS亞基組成進(jìn)行電泳分析；發(fā)現(xiàn)HMW-GS亞基組成在加倍單倍體后代和自交后代中均存在變異，而且在一些正、反雜交組合中存在差異，這對于小麥品質(zhì)性狀的基礎(chǔ)理論研究和育種實(shí)踐具有一定意義。1 材料與方法1.1 小麥材料小麥材料Verry、Alondra、Orofen和百農(nóng)3217（BN3217）由國家作物種質(zhì)資源保存中心提供，京771（J771）

15、、中國春（CS）、中優(yōu)9507（ZY9507）、新春9號（XC9）、CB037、寧春4號（NC4）、Bobwhite、揚(yáng)麥12（YM12）、WM151A、石4185（S4185）和京冬8號（JD8）由本課題組收集保存。其中，Verry、Alondra、Orofen、新春9號和百農(nóng)3217用于花藥培養(yǎng)，獲得加倍單倍體群體；京771、CS、新春9號，CB037、寧春4號、Bobwhite、揚(yáng)麥12、京冬8號和石4185用于配制雜交組合，相互間共制了24個正、反交組合；京771、CS和中優(yōu)9507作為高分子量麥谷蛋白亞基分析的標(biāo)準(zhǔn)對照品種。1.2 花藥培養(yǎng)孕穗期取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的小麥幼穗，

16、置于4冰箱中處理3 d21，接種前用75%乙醇表面擦拭消毒，無菌條件下取出花藥接種在W14附加2.0 mg/L 2,4-D、10%蔗糖和8 g/L瓊脂（pH 6.0）固體培養(yǎng)基上，28、黑暗條件下培養(yǎng)3040 d誘導(dǎo)愈傷組織。將直徑1 mm左右大小的愈傷組織轉(zhuǎn)移到1/2 MS附加1.0 mg/L KT、0.5 mg/L NAA、2%蔗糖、8 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 6.0）上，25、63 mol/m2s光照件下培養(yǎng)2030 d分化植株。將再生芽進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到1/2 MS附加0.5 mg/L IAA、1.0 mg/L多效唑、2%蔗糖、8 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 6.0）上壯苗和生根培。移栽前用清水

17、將根系上的培養(yǎng)基清洗干凈，將根系健壯的綠苗移入溫室20。1.3 麥谷蛋白提取單粒風(fēng)干種子在-80液態(tài)氮中充分研碎，加入1ml 70%乙醇，渦旋振蕩30 min，12000 rpm離心 10 min,棄上清后干燥；加入1ml 55%異丙醇，混勻并渦旋，65水浴30 min，12000 rpm離心10min，充分干燥；加入120 l溶液B（50%異丙醇+0.2M Tris-HCl pH 8.0，新鮮加入二硫蘇糖醇DTT達(dá)1%），混勻渦旋，放入65水浴30 min；加入100 l溶液B（50%異丙醇+0.2M Tris-Hcl，pH 8.0，加入4-乙烯吡啶達(dá)1.4%，渦旋混勻；65水浴30 min

18、，12000 rpm離心10 min；上清液轉(zhuǎn)入新離心管，12000 rpm離心10 min，吸取100 l上清液轉(zhuǎn)入新離心管，加入等體積的Glu-buffer（20%SDS；0.02%溴酚蘭；0.08M Tris-HCl pH 8.0；40%甘油）,65水浴30 min，12000 rpm離心10 min22。1.4 SDS先配制12%的分離膠，凝聚一個小時后灌入10%的濃縮膠，插入梳子后再凝聚一個小時以上用做電泳。上樣量為610 l/孔，穩(wěn)流15 mA/gel 20 min后，穩(wěn)流20 mA/gel，電泳2.54小時后將膠放入SDS染色液（0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250,45%乙醇，10%冰

19、乙酸）中，過夜染色。倒掉染色液，加入SDS脫色液（10乙醇，10冰乙酸），在搖床上脫色23次，在膠片觀察燈上看到清晰的蛋白條帶時用凝膠掃膠儀（清華紫光e100）掃描保存23。1.5 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查加倍單倍體和對照品種2009年2月種植在寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所試驗(yàn)基地，生育期間調(diào)查出苗期、抽穗期和成熟期，收獲前每個材料隨即取10株調(diào)查株高、穗粒數(shù)，脫粒后測定千粒重、粒色等主要農(nóng)藝性狀。2 結(jié)果與分析2.1 加倍單倍體植株獲得以5個小麥基因型Verry、Alondra、Orofen、新春9號、百農(nóng)3217為材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，其中，接種Verry花藥3882枚，誘導(dǎo)出愈傷組織1054塊，獲得可

20、育株42株，出愈率為27.2%，加倍率28.4%；接種Alondra花藥924枚，誘導(dǎo)出愈傷組織317塊，獲得可育株40株，出愈率34.3%，加倍率為35.1%；接種Orofen花藥1860枚，誘導(dǎo)出愈傷組織234塊，獲得可育株29株，出愈率為12.6%，加倍率為29.6%；接種新春9號花藥數(shù)2540枚，誘導(dǎo)出愈傷組織435塊，獲得可育株21株，出愈率17.1%，加倍率29.6%；接種百農(nóng)3217花藥數(shù)11081枚，誘導(dǎo)出愈傷組織43塊，獲得可育株2株，出愈率0.4%，加倍率40.0%（表1）。表1 不同小麥基因型花藥培養(yǎng)獲得加倍單倍體情況Table 1 Callus induction an

21、d plantlet induction directly from wheat anthers in different media基因型Genotypes花藥數(shù)Anthers inoculated愈傷組織數(shù)Callus number愈傷組織誘導(dǎo)率（%）Percentage of calli不育株Sterile plants可育株Fertile plants加倍率(%)Doubling frequencyVerry3882105427.21064228.4Alondra92431734.3744035.1Orofen186023412.6692929.6新春9號254043517.15021

22、29.6百農(nóng)321711081430.43240.02.2 加倍單倍體高分子量麥谷蛋白亞基變異分析對Alondra花藥培養(yǎng)獲得的40個株系進(jìn)行SDS分析結(jié)果表明，在其中的21個株系中高分子量麥谷蛋白亞基組成出現(xiàn)了變異（圖1），變異率為52.5%。進(jìn)一步以對照品種中優(yōu)9507（HMW亞基組成為：1，7+9，5+10）、京771（HMW亞基組成為：1，17+18，5+10）和中國春（HMW亞基組成為：Null，7+8，2+12）為參照，分析Alondra加倍單倍體高分子量麥谷蛋白亞基組成，發(fā)現(xiàn)其變異主要分為二類，第一類與中優(yōu)9507類似，亞基組成可能為（1，7+9，5+10）；第二類與中國春類似，

23、亞基組成可能為（Null，7+8，2+12）。這二類變異中也可能有新亞基，需要進(jìn)一步鑒定。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30圖1 Alondra加倍單倍體高分子量麥谷蛋白亞基組成分析Fig. 1 HMW-GS composition analysis of the doubling haploids derived from Alondra1-4，6-10，11，13-20，21-24，26-30：Alondra加倍單倍體；5，12，25：Alondra對Verry花

24、藥培養(yǎng)獲得的42個株系的SDS分析結(jié)果表明，在其中的7個株系中高分子量麥谷蛋白亞基組成出現(xiàn)了變異（圖2），變異率為16.7%。以標(biāo)準(zhǔn)品種中優(yōu)9507（1，7+9，5+10）、京771（1，17+18，5+10）和中國春（Null，7+8，2+12）為參照辨別高分子量麥谷蛋白亞基組成。結(jié)果表明，Verry花培無性系高分子量麥谷蛋白亞基組成發(fā)生了穩(wěn)定性變異，主要分為二類，第一類與中優(yōu)9507類似，第二類屬于一種新類型，亞基組成可能為（Null，7+18，5+10）。也可能出現(xiàn)了新亞基，有待進(jìn)一步分析。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16圖2 Verry加倍單

25、倍體高分子量麥谷蛋白亞基組成分析Fig. 2 HMW-GS composition analysis of the doubling haploids derived from Verry1，11：中優(yōu)9507；2：:京771；3，12：Verry ；4-10，13-15：Verry加倍單倍體；16：中國春對百農(nóng)3217花藥培養(yǎng)獲得的2個株系的SDS分析結(jié)果表明，在這2個株系中高分子量麥谷蛋白亞基組成比百農(nóng)3217多了一條帶（圖3），與1號亞基類似，推測其亞基組成為（1，7+8，2+12），可能有新亞基出現(xiàn)。由于獲得的加倍單倍體較少，變異情況有待進(jìn)一步研究。 1 2 3 4 5 6圖3 百農(nóng)3

26、217加倍單倍體高分子量麥谷蛋白亞基變異分析Fig. 3 HMW-GS composition analysis of the doubling haploids derived from Beinong32171：中優(yōu)9507；2：京771；3：Alondra；4：百農(nóng)3217；5-6：百農(nóng)3217加倍單倍體同樣，對新春9號21個加倍單倍體株系和Orofen 29個加倍單倍體株系子粒中的麥谷蛋白進(jìn)行SDS分析。結(jié)果表明，這50個加倍單倍體分別與對照品種新春9號和Orofen相比，高分子量麥谷蛋白亞基組成沒有發(fā)生變異。2.3 典型HMW-GS組成變異加倍單倍體主要農(nóng)藝性狀加倍單倍體主要農(nóng)藝性狀

27、調(diào)查結(jié)果顯示，HMW-GS組成發(fā)生變異的加倍單倍體在株高、生育期、子粒顏色等主要性狀上與對照品種一致（表2），穗粒數(shù)比相應(yīng)對照略有減少，千粒重比相應(yīng)對照略有提高。表明典型HMW-GS變異加倍單倍體的主要植物學(xué)性狀與對照基本一致，在有關(guān)品質(zhì)性狀的HMW組成上發(fā)生了變異。表2 部分HMW-GS組成變異加倍單倍體農(nóng)藝性狀Table 2 Main agronomic characteristics of some haploids with variation in HMW-GS composition材料編號Material name or ID株高(cm)Plant heightt生育期(d)Gr

28、owth period穗粒數(shù)Grains per spike穗粒重(g)Grain weight per spike千粒重(g)1000 grains weight子粒顏色Grains colorVerry(CK)9410143.72.440.1紅1043-Ve-39510139.52.348.6紅1048-Ve-89310143.52.039.6紅1055-Ve-359010142.82.641.0紅Alondra(CK)9810142.12.743.2紅1098-Al-79710139.42.647.6紅1110-Al-319810136.02.748.2紅1122-Al-38981013

29、6.32.746.3紅2.4 不同雜交組合中高分子量麥谷蛋白亞基表達(dá)和變異分別用京771、CS、新春9號、CB037、寧春4號、Bobwhite、揚(yáng)麥12、京冬8號和WM151A等品種配制正、反雜交組合，對F1雜種子粒中的高分子量麥谷蛋白進(jìn)行SDS分析（圖4）。結(jié)果表明，新春9號/Bobwhite組合和Bobwhite/新春9號組合中含有雙親所有亞基(1+2，7+9，5+10)，表現(xiàn)為共顯性表達(dá)，正、反雜交組合中亞基相同。寧春4號/京冬8號組合中含有雙親的所有9個亞基(1，7+9+17+18，2+12+5+10)，表現(xiàn)為共表達(dá)。寧春4號/WM151A組合中含有雙親寧春4號和WM151A中全部7

30、個亞基(1，7+9，17+18，5+10)，所有亞基表現(xiàn)為共表達(dá)。寧春4號/新春9號組合中含有雙親的7個亞基(1，7+9+17+18，5+10)，表現(xiàn)為共表達(dá)。京771/CS組合中含有雙親的8個亞基(1，7+8+17+18，2+5+10)，CS最小亞基（12）被抑制，其他亞基表現(xiàn)為共表達(dá)。京771/新春9號組合和新春9號/京771組合中只含有京771的5個亞基(1，17+18，5+10)，新春9號中的2個亞基（7+9）被抑制，正、反雜交組合中亞基表現(xiàn)相同。CS/寧春4號組合和寧春4號/CS組合含有雙親的8個亞基(1，7+8+17+18，2+12+5+10)，CS最小亞基（12）被抑制，其他亞基

31、表現(xiàn)為共表達(dá)，正、反雜交組合中亞基表達(dá)相同。CS/新春9號組合和新春9號/CS組合中含有雙親的7個亞基(1，7+8+19，2+5+10)，CS最小亞基（12）被抑制，其他亞基表現(xiàn)為共表達(dá)，正、反雜交組合中亞基表達(dá)相同。 37 38 39 40 41 42 43 441 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 圖4 部分F1雜種及親本高分子量麥谷蛋白亞基SDS分析Fig. 4 HMW-GS composition analysis of some

32、 F1 crossing hybrids and their parents1, 16, 38: CS; 2: J771/CS; 3, 20, 29: J771; 4: J771/XC9; 5: XC9/J771; 6, 19:XC9; 7: XC9/Bobwhite; 8: Bobwhite/XC9; 9, 41: Bobwhite; 10: JD8; 11: NC4/JD8; 12:NC4/XC9; 13, 26, 32, 44: NC4; 14: CS/NC4; 15: NC4/CS; 17: CS/XC9; 18: XC9/CS; 21: J771/CB037; 22: CB037/J

33、771; 23: CB037; 24: NC4/CB037; 25: CB037/NC4; 27: NC/WM151A; 28: WM151A; 30: J771/NC4; 31: NC4/J771; 33: NC4/YM12; 34: YM12/NC4; 35: YM12; 36: Verry; 37: S4185; 39: CS/Bobwhite; 40: Bobwhite /CS; 42: Bobwhite /NC4; 43: NC4/BobwhiteCS/Bobwhite正交組合中表達(dá)了雙親的6個亞基(7+8，2+12+5+10)，亞基2*被抑制，Bobwhite/CS反交組合中表達(dá)了

34、雙親的6個亞基(2*，7+8，12+5+10)，2亞基被抑制。Bobwhite/寧春4號正交組合中表達(dá)了雙親的7個亞基(1+2*，7+17+18，5+10)，而寧春4號/Bobwhite反交組合中表達(dá)了雙親的5個亞基(1+2*，7，5+10)，來源于寧春4號的亞基（17+18）被抑制。京771/CB037正交組合中含有雙親的5個亞基(1，17+18，5+10)，來源于CB037的（2+12）亞基被抑制，其他亞基表現(xiàn)為共表達(dá)，CB037/京771反交組合中含有雙親的6個亞基(1，17+18，2+5+10)，來源于CB037的2亞基被抑制，其他亞基表現(xiàn)為共表達(dá)，說明京771細(xì)胞質(zhì)對12亞基的表達(dá)有

35、影響。寧春4號/CB037正交組合中含有雙親的6個亞基(1，17+18，2+5+10)，來源于CB037的12亞基被抑制，CB037/寧春4號反交組合中含有雙親的6個亞基(1，17+18，2+5+10)，來源于CB037的12亞基同樣被抑制，但出現(xiàn)了1個與7亞基大小相似的新帶，其他亞基表現(xiàn)為共表達(dá)。京771和寧春4號高分子量麥谷蛋白亞基組成完全相同，京771/寧春4號正交組合中表達(dá)了雙親的5個亞基(1，17+18，5+10)，而寧春4號/京771反交組合中除了表達(dá)雙親的5個亞基(1，17+18，5+10)外，出現(xiàn)了2個新帶，一條帶的大小與7亞基類似，另一條帶的大小與8亞基類似。寧春4號/揚(yáng)麥1

36、2正交組合中表達(dá)了雙親的7個亞基(1，8 +18，2+12+5+10)，亞基（7+17）被抑制，揚(yáng)麥12 /寧春4號反交組合中表達(dá)了雙親的8個亞基(1，7+8+17+18，2+5+12)，10亞基被抑制。2.5 典型雜交組合后代中HMW-GS新亞基跟蹤選擇和純合利用SDS從寧春4號/CB037組合、京771/寧春4號組合的F2代子粒中選擇含有HMW-GS新亞基的單株進(jìn)行自交，F(xiàn)3代繼續(xù)選擇含有新亞基的單株自交，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)選擇亞基在F4代子粒中已基本純合（圖5）。寧春4號/CB037組合的純合株系中含有與7亞基大小相似的新帶，京771/寧春4號組合的純合株系中含有與7亞基大小相似新帶的同時，17亞

37、基被抑制。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10圖5 寧春4號/CB037組合、京771/寧春4號組合的純合株系HMW-GS組成鑒定Fig. 5 Identification of HMW-GS constitution in the stable lines from the crosses of Ningchun4/CB037 and Jing771/Ningchun41：CB037；2：寧春4號；3-5：寧春4號/CB037組合F4代純合株系；6：寧春4號；7：京771；8-10：京771/寧春4號組合F4代純合株系3 討論3.1 組織培養(yǎng)與性狀變異研究表明，在組織培養(yǎng)過程中多倍體物種

38、比低倍性物種具有更高的變異性24。黑麥草的組織培養(yǎng)過程中已發(fā)現(xiàn)許多表型及染色體結(jié)構(gòu)變化25。而引起組織培養(yǎng)過程中這些變化的主要原因有點(diǎn)突變、染色體重排及重組、DNA甲基化、基因拷貝數(shù)的變化及轉(zhuǎn)座子元件的插入等24。Phillips等26認(rèn)為由于組織培養(yǎng)過程能夠打破正常的細(xì)胞分裂，從而導(dǎo)致染色體斷裂進(jìn)而引起一系列染色體結(jié)構(gòu)異常，如缺失、重復(fù)、倒位及易位27。此外，組織培養(yǎng)過程能夠活化一些轉(zhuǎn)座子，如水稻轉(zhuǎn)座子Tos17，隨著組織培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)也增加至530個，進(jìn)而誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異28。Banks等29利用中間偃麥草與小麥雜交，并結(jié)合組織培養(yǎng)將中間偃麥草抗黃矮病基因轉(zhuǎn)入小麥，在12

39、00個后代群體中發(fā)現(xiàn)8株穩(wěn)定抗病。離體花藥由于染色體和基因組的單倍行，培養(yǎng)過程中可能更容易發(fā)生染色體斷裂和重融，導(dǎo)致DNA序列的重組或丟失30。本研究在Alondra、Orofen、Verry、新春9號和百農(nóng)3217的134個花藥培養(yǎng)加倍單倍體群體中，30個加倍單倍體的高分子量麥谷蛋白亞基組成發(fā)生了變異，變異率為22.4%。Alondra和百農(nóng)3217加倍單倍體高分子量麥谷蛋白亞基發(fā)生了頻繁變異，Alondra加倍單倍體中HMW-GS變異率達(dá)61.8%，Verry加倍單倍體次之，Orofen和新春9號加倍單倍體中沒有發(fā)現(xiàn)變異。小麥花藥無性系中高分子量麥谷蛋白亞基發(fā)生變異可能起因于有絲分裂異常，

40、產(chǎn)生了染色體結(jié)構(gòu)變異或HMW-GS編碼基因DNA序列的丟失。認(rèn)為花藥培養(yǎng)非常容易誘發(fā)HMW-GS組成變異，可以用來改良優(yōu)良小麥品質(zhì)。3.2 HMW亞基組成和表達(dá)在雜交組合中的變異以前的研究認(rèn)為，HMW-GS在F1雜種中呈共顯性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)對HMW-GS表達(dá)幾乎不影響14-16。本研究結(jié)果表明，HMW-GS的確在大多數(shù)F1雜種中共表達(dá)。但在寧春4號/揚(yáng)麥12正交F1中表達(dá)了雙親中的7個亞基，（7+17）亞基沒有表達(dá)，在揚(yáng)麥12/寧春4號反交F1中表達(dá)了雙親中的8個亞基，10亞基被抑制；在京771/CB037正交F1中表達(dá)了雙親中的5個亞基，來源于CB037的（2+12）亞基被抑制，在CB037/

41、京771反交F1中表達(dá)了雙親CB037和京771中的6個亞基，來源于CB037的2亞基被抑制，表明高分子量麥谷蛋白亞基并非在所有F1組合中呈共顯性，細(xì)胞質(zhì)可能對HMW-GS表達(dá)有影響。在CB037/寧春4號和寧春4號/京771組合中分別出現(xiàn)了1個雙親所沒有的新亞基。這種雜交后代中HMW-GS表達(dá)被抑制和出現(xiàn)新亞基現(xiàn)象，可能是減數(shù)分裂過程中現(xiàn)了HMW-GS編碼基因部分DNA序列的丟失和基因內(nèi)部重組，也可能是基因結(jié)構(gòu)的變異。HMW-GS編碼基因是一個多基因家族，存在較多等位基因和復(fù)等位基因，相互間序列保守，含有較多DNA重復(fù)序列，在結(jié)構(gòu)上非常容易發(fā)生變異，如黑麥基因組異染色質(zhì)區(qū)域的重復(fù)序列增強(qiáng)黑麥

42、組織培養(yǎng)過程中染色體的不穩(wěn)定性31。此外，在編碼區(qū)氨基酸的突變和缺失會導(dǎo)致新的HMW-GS存在32。Zhang等33報道在利用從小麥中克隆的HMW-GS基因構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，HMW-GS基因也會發(fā)生序列丟失現(xiàn)象。Yan等34借助普通SDS、A及CE相結(jié)合技術(shù)對198個粗山羊草（Aegilops tauschii）品種HMW-GS研究表明許多等位變異的存在，其中包括一些新的x-及y-型亞基以及許多新的亞基組合。而這些新出現(xiàn)的高分子量亞基被認(rèn)為可能是由普通六倍體小麥內(nèi)幾種HMW-GS編碼基因之間稀有的不均等交換產(chǎn)生35。本研究發(fā)現(xiàn)，在小麥品種間雜交后代中HMW-GS的遺傳和表達(dá)并不一定呈完全共

43、顯性，在一些組合中個別亞基的表達(dá)被抑制，甚至出現(xiàn)雙親所沒有的新亞基。HMW-GS表達(dá)在一些正、反交組合中結(jié)果不完全一致，也存在細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。品種間雜交后代中應(yīng)加強(qiáng)對HMW-GS組成的鑒定和選擇，定向培育優(yōu)質(zhì)小麥新品種。小麥花藥培養(yǎng)和雜交重組誘發(fā)了HMW-GS組成變異，其原因有待探討，新亞基有待進(jìn)一步鑒定?；ㄋ幣囵B(yǎng)和品種間雜交誘發(fā)HMW-GS組成變異現(xiàn)象可以用來獲得新亞基編碼基因，在改良小麥HMW-GS亞基組成方面具有一定潛力。參考文獻(xiàn)1 Kolster P, Krechting C F, van Gelder W M. Quantification of individual high mole

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