干細(xì)胞及其應(yīng)用20151015

1、干細(xì)胞及其應(yīng)用高志買江蘇銀豐鼎城生物工程有限公司南京軍區(qū)干細(xì)胞庫2Science于1999年和2000年連續(xù)兩次將干細(xì)胞技術(shù)評為世界十大科學(xué)成就之一干細(xì)胞技術(shù)是醫(yī)學(xué)發(fā)展的未來3干細(xì)胞技術(shù)是醫(yī)學(xué)發(fā)展的未來干細(xì)胞基本知識干細(xì)胞分類來源及功能干細(xì)胞(stem cells, SC)是指一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)和分化（differentiating）潛能的細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。定義：恩尼斯特莫科洛克和詹姆士堤爾脾臟來源細(xì)胞集落形成的發(fā)現(xiàn)開啟了干細(xì)胞研究的大門1、BECKER AJ,McCULLOCH EA,TILL JE.Cytological demo

2、nstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells。Nature.1963 Feb2;197:452-4.2、SIMINOVITCH L,MCCULLOCH EA,TILL JE. THE DISTRIBUTION OF COLONY-FORMING CELLS AMONG SPLEEN COLONIES. J Cell Physiol.1963 Dec;62:327-36.胚胎干細(xì)胞根據(jù)發(fā)育過程分類人類56天的胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞根據(jù)功能性分類全能干細(xì)胞多

3、功能干細(xì)胞單功能干細(xì)胞成肌細(xì)胞造血干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞用于臨床的干細(xì)胞來源自體外周血自體骨髓3 胎盤及其附屬物（臍帶、臍血）4 脂肪、牙周組織9 目前細(xì)胞治療常用的細(xì)胞種類一：骨髓總有核細(xì)胞（NC） 從自體骨髓獲得，去除大部分紅細(xì)胞，剩下的全部有核細(xì)胞。 其中富含各系血細(xì)胞、造血干細(xì)胞、造血各系祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。910目前細(xì)胞治療常用的細(xì)胞種類二：單個(gè)核細(xì)胞（MNC） 從自體骨髓或異體臍血中獲得，去除絕大部分紅細(xì)胞、血小板、巨核細(xì)胞和多核細(xì)胞，剩下的單個(gè)核細(xì)胞。 其中富含胚胎樣多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、造血各系祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。1011目前細(xì)胞治療常用的細(xì)胞種類三：CD34+細(xì)

4、胞 （HSC & EPC） 從骨髓或臍血單個(gè)核細(xì)胞中經(jīng)免疫磁珠法分選的表達(dá)CD34糖蛋白的細(xì)胞。 其中造血干細(xì)胞和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的純度極高，對實(shí)驗(yàn)室人員操作要求較高。1112目前細(xì)胞治療常用的細(xì)胞種類四：間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC） 首先分離骨髓、臍帶或脂肪組織的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)獲得貼壁細(xì)胞群，呈梭形，體型較大，能分化為多種細(xì)胞。 其中富含間質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。還殘留少量單個(gè)核細(xì)胞。對實(shí)驗(yàn)室操作人員要求較高。 起源于中胚層，存在于骨髓、臍帶、臍血、脂肪、乳牙組織、胎盤等，具備干細(xì)胞的自我復(fù)制和多向分化性，在發(fā)育的不同階段和特定環(huán)境條件下，能分化為多種間質(zhì)起源的組

5、織。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）國際細(xì)胞療法間充質(zhì)與組織干細(xì)胞委員會( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低標(biāo)準(zhǔn)：形態(tài)：在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下呈貼壁生長細(xì)胞表型：表達(dá)CD105, CD73和CD90,不表達(dá)CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 分化功能：在體外至少能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。15FACS檢測干細(xì)胞的免疫表型16MSC來

6、源取材操作細(xì)胞含量增殖分化能力免疫原性倫理爭議骨髓有創(chuàng)，痛苦較低較低，受年齡影響較高存在脂肪有創(chuàng)較高較強(qiáng)，受年齡影響較高存在臍血無創(chuàng)極低較強(qiáng)，無年齡影響低無臍帶組織無創(chuàng)豐富較強(qiáng)，無年齡影響低無不同來源MSC生物特性比較18自體骨髓 MSC 的優(yōu)點(diǎn)取自自身，不受倫理、道德及法律方面的限制；無HLA限制，無GVHD和HVGD；可多向分化，在神經(jīng)、心肌等細(xì)胞治療方面具有廣闊的臨床前景?？烧{(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，適宜于自身免疫病的調(diào)節(jié)。自體骨髓 MSC 的缺點(diǎn)過程痛苦；老人和某些患者（如運(yùn)動神經(jīng)元?。o法擴(kuò)增培養(yǎng)；生長慢。19臍帶 MSC 的優(yōu)點(diǎn)取材方便，易于收集、保存和冷凍。不受倫理、道德及法律方面的限制。由

7、于胎血屏障，沒有病毒污染，使其在神經(jīng)、心肌等細(xì)胞治療方面具有廣闊的臨床前景。人臍帶MSCs含量豐富，較為原始，分化能力強(qiáng)，可在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)，擴(kuò)增迅速，且生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴(kuò)增仍能保持旺盛功能，可以為臨床提供充足的細(xì)胞來源。人臍帶MSCs不表達(dá)或低表達(dá)免疫排斥相關(guān)標(biāo)記，免疫原性低，是一類免疫缺陷細(xì)胞，不須經(jīng)過嚴(yán)格配對使用，異體移植無免疫排斥反應(yīng)或反物較弱，適宜于不同個(gè)體之間的移植，是細(xì)胞治療的理想的工具細(xì)胞。20自體骨髓 MSC 的優(yōu)點(diǎn)取自自身，不受倫理、道德及法律方面的限制；無HLA限制，無GVHD和HVGD；可多向分化，在神經(jīng)、心肌等細(xì)胞治療方面具有廣闊的臨床前景。可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，

8、適宜于自身免疫病的調(diào)節(jié)。自體骨髓 MSC 的缺點(diǎn)過程痛苦；老人和某些患者（如運(yùn)動神經(jīng)元?。o法擴(kuò)增培養(yǎng)；在某些疾病中使用自身MSC可能會加重（如肝硬化）；生長慢。21臍帶 MSC 的優(yōu)點(diǎn)取材方便，易于收集、保存和冷凍。不受倫理、道德及法律方面的限制。由于胎血屏障，沒有病毒污染，使其在神經(jīng)、心肌等細(xì)胞治療方面具有廣闊的臨床前景。人臍帶MSCs含量豐富，較為原始，分化能力強(qiáng)，可在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)，擴(kuò)增迅速，且生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴(kuò)增仍能保持旺盛功能，可以為臨床提供充足的細(xì)胞來源。人臍帶MSCs不表達(dá)或低表達(dá)免疫排斥相關(guān)標(biāo)記，免疫原性低，是一類免疫缺陷細(xì)胞，不須經(jīng)過嚴(yán)格配對使用，異體移植無免疫排

9、斥反應(yīng)或反物應(yīng)較弱，適宜于不同個(gè)體之間的移植，是細(xì)胞治療的理想的工具細(xì)胞。HUMSC制備方法臍帶組織結(jié)構(gòu)：臍帶由兩條動脈、一條靜脈、粘液結(jié)締組織（華通膠，Whartons Jelly）及羊膜上皮組織構(gòu)成。臍帶血管內(nèi)皮及內(nèi)皮下、羊膜上皮組織也能培養(yǎng)出MSC樣細(xì)胞，但細(xì)胞表型、分化功能不夠完整。華通膠成為HUMSC的主要來源部分。HUMSC制備流程HUMSC制備方法母血病毒檢測洗滌 分離華通膠組織貼壁培養(yǎng)傳代培養(yǎng)種子凍存細(xì)胞復(fù)蘇傳代擴(kuò)增微生物，支/衣原體、內(nèi)毒素檢測微生物檢測，支/衣原體、內(nèi)毒素檢測收獲灌裝臍帶采集MSC臨床治療機(jī)制替代和修復(fù)死亡和受損傷的細(xì)胞激活休眠和處于抑制狀態(tài)的細(xì)胞旁分泌作用

10、（分泌趨化因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗凋亡因子等）免疫調(diào)控機(jī)制（誘導(dǎo)免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)）促進(jìn)細(xì)胞間電能力、電傳導(dǎo)的恢復(fù)（分泌連接蛋白幫助細(xì)胞間連接、促進(jìn)離子通道的開放等）MSC的適應(yīng)癥自身免疫性疾病神經(jīng)系統(tǒng)疾病消化系統(tǒng)疾病骨骼及運(yùn)動系統(tǒng)疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病共濟(jì)失調(diào)、帕金森、脊髓損傷、腦萎縮、老年癡呆、運(yùn)動神經(jīng)元病、多發(fā)性硬化、腦中風(fēng)、腦癱肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏病股骨頭缺血性壞死、關(guān)節(jié)軟骨病變、骨折不愈合及延遲愈合心腦血管疾病呼吸系統(tǒng)疾病泌尿系統(tǒng)疾病內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病心肌梗塞、腦梗塞、冠心病、缺血缺氧性腦病肺動脈高壓、肺纖維化慢性腎小球炎、腎病綜合征、高血壓腎病、糖尿病腎病

11、及所致的急慢性腎衰竭糖尿病、下肢血管性疾病、糖尿病足眼科疾病美容亞健康視神經(jīng)萎縮、黃斑病變供者M(jìn)SC聯(lián)合HSC移植明顯降低了GVHD的發(fā)生率臨床結(jié)果MSC n=10Non-MSCn=15急性GVHDGrade II-IV11.1% (1/9)53.3% (8/15)慢性GVHD14.3% (1/7)28.6% (4/14)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院307醫(yī)院血液科陳虎主任Leukemia.2008；22：593-599.（IF 8.6)（同期刊發(fā)表兩篇專家述評）Leukemia.2009；23：179-180.（IF 8.6)髓芯減壓聯(lián)合干細(xì)胞治療股骨頭壞死Indian J Orthop. 2009 Ja

12、n-Mar; 43(1): 4045.干細(xì)胞治療骨不連干細(xì)胞治療卵巢早衰PLoS ONE 7(3): e32462. doi:10.1371Development of the ovary in BMT animal (A) compared to untreated control animal (B).脂肪來源MSC在豐胸上的應(yīng)用人數(shù)：40平均輸入脂肪體積270ml平均乳房增大100-200ml2個(gè)月后未見明顯的萎縮幾乎所有人都對柔軟且外觀自然的豐胸效果表示滿意Preoperative (top) and postoperative (bottom) views at 24 months.

13、 A 30-year-old woman underwent breast augmentation with cell-assisted lipotransfer (CAL) (310 ml in each breast). Her breasts were dramatically augmented with an increase in breast circumference difference by 8 cm at 24 months. The breast mounds were soft with no subcutaneous indurations.Radiologic

14、views of patient 3. (A) A preoperative computed tomography (CT) image in the horizontal plane at the level of the nipples. Only a very thin fatty layer is observed around the mammary glands. (B) A horizontal magnetic resonance image (MRI) (T1 weighted) 24 months after surgery. Transplanted adipose t

15、issues survived and formed thick layers around and under the mammary glands. (C) Mammograms 24 months after surgery show no abnormal signs脂肪來源MSC的抗皺效果Evaluation of wrinkles by replica analysis after ADSC injection. Control (A), 1 *103 cells (B), 1*104 cells (C), and 1*105 cells (D).Representative clinical photography of fractional carbon dioxide laser-treated sites. The ADSC-CM-treated side shows less erythema and hyperpigmentation. FxCR 8 mJ with ADSC-CM (T1), FxCR 8 mJ with DMEM medium (C1), FxCR 16 mJ with ADSC-CM (T2), and FxCR 16 mJ with DMEM medium (C2)