試驗總結(jié)-Westernblot

1、WesternBlotWesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)WB-蛋白提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮

2、、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制齊I（PMSF。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點的

3、兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15mol/l濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用

4、乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。一、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。? .倒掉培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)皿倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液2 .每皿細(xì)胞加1ml4c預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.27.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄

5、凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3 .按1ml裂解液加10叱PMSF100mM）,搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）4 .每皿細(xì)胞加400”含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)皿要經(jīng)常來回?fù)u動。5 .裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）6 .于4C下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）7 .將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于-20C保存。二、組織中總蛋白的提?。? .將少量組織塊置于12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織

6、塊盡量剪碎。2 .加400小單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。3 .幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4 .裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4c下12000rpm離心5min,取上滿分裝于0.5ml離心管中并置于-20C保存。三、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊懀恍┘?xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：1 .將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。2 .棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm

7、離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。3 .用槍洗干上清后，加100以裂解液（含PMSF冰上裂解30min,裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4 .將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4c.12000rpm離心5min,取上滿分裝于0.5ml離心管中并置于-20C保存。（可在蛋白濃度測定結(jié)束后用SDSffi釋蛋白后再保存）WB-BCA蛋白含量測定一、原理：BCA(bicinchoninincacid分二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+,一個Cu+螯合二個BCA分子，工作試劑由原

8、來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。二、產(chǎn)品特點：1 .步驟簡單，45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典Lowry法快4倍而且更加方便。2 .靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25ug/ml,最小檢測蛋白量達(dá)到0.5ug,待測樣品體積為1-20ul。3 .在50-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。4 .檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。三、注意事項：1 .蛋白標(biāo)準(zhǔn)品需在全部溶解后先混勻，再稀釋再稀釋成一系列不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)品曲線配制時，如果吸量不準(zhǔn)確或者加

9、樣槍不精確會造成標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)減小，可根據(jù)需要使用倍比梯度稀釋的方法來配制，或者使用精確度高的加樣槍。2 .SolutionA和SolutionB混合成工作液時可能會有渾濁，但充分振蕩混勻后就會消失，成為淡綠色的透明溶液。3 .需酶標(biāo)儀一臺，測定波長為540-590nm之間，562nm最佳；需96孔板。如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計測定，但是測定蛋白濃度時，需根據(jù)測定吸光度的杯子的體積，按比例調(diào)整A液，B液和樣品的體積。使用分光光度計測定蛋白濃度時，每個試劑盒可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。4 .BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的S

10、DS5%的TritonX-100,5%的Tween20,60,8。但受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM,無EGTA二硫蘇糖醇低于1mM,&琉基乙酉!低于1mM.不適用BCA法時建議使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒。還可以考慮用超純水稀釋，透析/除鹽，ACETONE/TC航淀蛋白后重溶于超純水等方法來消除干擾物質(zhì)的影響。5,為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)用微波爐加熱，但是切勿過熱。6.如發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身就有較高背景，可試用Bradford法蛋白定量四、操作步驟：1 .使用時將SolutionA搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solu

11、tionA加1體積SolutionB(50:1)配制適量BCAX作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。2 .蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(0.5mg/mlBSA):取10ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/ml)稀釋至100ul,使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用去離子水，0.9%NaC或PBSW釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。3 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑孔號01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(pD01248121620去離子水(以12019181612840對應(yīng)蛋白含量(M00.51.02.04.06.08.010.0丸號0123456皆白

12、嬴(|il)0124S1216K加；2019181612B4相應(yīng)張白質(zhì)含003124«4,加適當(dāng)體積(1曲樣品到96孔板的樣品空中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20微升.5 .各孔加入200pLBCA作液，37c放置30分鐘。然后在562nm下酶標(biāo)儀比色測定。也可以在室溫放置2小時，或60c放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。6 .(BCA550以蛋白含量(小。為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量及濃度，乘以樣品稀釋倍數(shù)即

13、為樣品實際濃度。WBSDS-PAGBfe泳一、原理：聚丙烯酰氨凝膠（PAGE電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法?；瘜W(xué)聚合以過硫酸錢（APS為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED為加速劑。在聚合過程中，TEMEI#化過硫酸錢產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電

14、荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑琉基乙醇（SDSW十二烷基硫酸鈉）后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?qiáng)還原劑如琉基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電，在樣品和凝膠中加入還原劑和SDSt,分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDSg合成蛋白-SDS膠束，使各種蛋白質(zhì)一SDS

15、M合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)問原有的電荷差別，SDSf蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)一SDSM合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDSM合物的短軸長度都一樣，約為18A（1A=10的負(fù)十次方米），這樣的蛋白質(zhì)一SDSM合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小由于蛋白質(zhì)一SDSM合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠，進(jìn)入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的

16、阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成一穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃

17、縮成一中間層SDS-PAGE般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。PAGE艮據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH,凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCl。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9

18、Tris-HClo電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素因而SD磔丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW；分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SD4聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢

19、測，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶。SD4聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設(shè)計提純過程都是非常重要的。二、試劑作用1 .過硫酸錢（APS）為催化劑2 .四甲基乙二胺（TEMED為加速劑：APS提供自由基；TEMED催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)。在聚合過程中，TEMED崔化過硫酸錢產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3 .SD

20、S是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，去蛋白質(zhì)電荷、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。4 .強(qiáng)還原劑如琉基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS吉合成蛋白-SDS交束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。5 .聚丙烯酰胺一一為蛋白質(zhì)電泳提供載體，具凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；凝膠濃度（%分子量范圍（KB）525-2001010-7015<5020<40

21、三、步驟：（一）清洗玻璃板一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗滌劑輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸儲水沖洗干凈后立在專用架子上晾干。（二）灌膠與上樣1 .玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（可以用1%瓊脂糖在垂直電泳槽的左.右和下部封邊，五分鐘后重復(fù)一次，這樣可以保證基本不漏膠。少用）2 .按前面方法配分離膠（根據(jù)蛋白分子量選擇分離膠的濃度），加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水或甲醇，液封后的膠凝的更快。注意：灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿

22、玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。3 .當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。冉等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。4 .按前面方法配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。（由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。少用）待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5 .用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（可提前配膠備用，沒有立即使用的膠配

23、好后放在電泳液或雙蒸水中，放4c冰箱保存）6,測完蛋白含量后，計算含20-50屋蛋白（注意：根據(jù)自己的實驗需要進(jìn)行選擇，沒有固定的量）的溶液體積即為上樣量。上樣前要將樣品于沸水中煮5-10min使蛋白變性。（上樣總體積一般不超過15晨加樣孔的最大限度可加20小樣品，其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達(dá)到40晨膠做得很好的話50N也是問題不大的）一般實驗中，BCA測完蛋白濃度后，即將蛋白吸取到心得EP管中，加入5XSDSt樣緩沖7稀釋至1X后進(jìn)行保存蛋白（如吸取蛋白80ul加入20ul的5XSDS。也可加入SDS后將蛋白煮沸5-10min變性后再放入冰箱保存，防止降解。下次使用時再煮沸3m

24、in左右。（可以使用PCR儀進(jìn)行變性，加快速度，這樣就不用將水煮沸了，同時在水中煮蛋白樣品有下面弊端：1,EP管容易炸開，樣品丟失。2,容易進(jìn)水，使樣品體積增加，超過電泳最大上樣量。）7,加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（選取一個孔加入5ul蛋白marker：蛋白marker的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應(yīng)的分子量大小，還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度）注：加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次

25、，以免交叉污染（三）電泳1 .電泳時間一般1-2h,電壓一般90-120V.?電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開直流穩(wěn)壓電源，（濃縮膠時電壓適當(dāng)?shù)托?，跑的比較慢，可以調(diào)為90V到分離膠以后用120V跑，速度可以快點）2 .電泳至澳酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。WB一轉(zhuǎn)膜、原理:電場力作用條件下，帶電粒子（PAGE交中的蛋白帶負(fù)電）會發(fā)生定向遷移；蛋白大小如果超過膜孔徑（0.22umor0.45um）,不會透過膜；WB用的膜具有蛋白吸附作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中都含有適量的甲醇，對于分子量較小的蛋白質(zhì)，甲醇能促進(jìn)它們固定在固相紙膜上，但對于大分子量蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)移緩沖液中是不宜加入甲醇

26、的。因甲醇使凝膠孔徑變小，不利于分子量較大的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移出。由于甲醇能將結(jié)合在堿性蛋白質(zhì)上面的SD9W離出來，而使其帶正電或呈電中性，蛋白質(zhì)也就更難從凝膠中轉(zhuǎn)移出。1 .硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預(yù)處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC!很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，不過要注意的是

27、純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途一一因為經(jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話最好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC一一混有含醋酸纖維（CM的NC膜結(jié)合力會有所降低。由于NC膜上結(jié)合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果最好）。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB勺靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇

28、。如果NC不攙雜一些醋化纖維素這在前面已經(jīng)提到，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。Protran由于是純NC膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)心自己“粗手粗腳”。2 .PVDF膜與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100祖g/cm2,而PVDF1結(jié)合量是100-200Ng/cm2（而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍?。５荘VDFF1最大的優(yōu)點不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF®在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，特別是需要做N端蛋白測序，在相

29、當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF1依然保持本色，笑傲江湖。所以PVD他是要做蛋白測序的唯一選擇。但不適合熒光。PVDF!特別注意的是需要100%P醇預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理。PVD映同¥分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會比前者稍高二、注意事項：1 .配制1X轉(zhuǎn)膜緩沖液（現(xiàn)配）。一般配制成10X轉(zhuǎn)膜緩沖液儲存。需要時配制成1X現(xiàn)用。2 .切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜，移液含甲醇，實驗室要開門以使空氣流通。3 .放置順序為：（白正

30、極）海綿-濾紙2層一PVDfig凝膠-濾紙2層一海綿（黑負(fù)級）。轉(zhuǎn)膜時電極方向注意是膜正膠負(fù)（黑-膠-膜）（大?。耗z濾紙PVDF膜）4 .用銀子捏住NC膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水；PVD映需用甲醇激活（15s）5 .將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（氣泡易導(dǎo)致短路）6 .要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃

31、板便開始松動，直到撬去玻板。7 .除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。8 .在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。9 .如果同時做兩塊膠，轉(zhuǎn)膜結(jié)束應(yīng)在膜上做標(biāo)記，以便查詢相應(yīng)樣本。10 .轉(zhuǎn)膜結(jié)束前配制封閉液及1XTBS琛沖7取110X稀釋）。三、步驟：1）電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備，將轉(zhuǎn)膜夾，切膠板等放在轉(zhuǎn)膜液終浸濕。2）常用濕轉(zhuǎn)，使用常規(guī)1X電轉(zhuǎn)液（現(xiàn)配）。一般

32、配制成10X轉(zhuǎn)膜緩沖液儲存。需要時配制成1X現(xiàn)用。3）浸泡NCB：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVD映則在甲醇中浸泡（15s）后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中平衡，使條帶不下彎。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。（在膜的一角切角做標(biāo)記）4）取膠：將膠卸下，根據(jù)所需蛋白分子量保留一定長度的膠，左上切角（做標(biāo)記），在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路），夾緊轉(zhuǎn)膜夾后。5）轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用雙蒸水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將轉(zhuǎn)膜夾封緊后放入電轉(zhuǎn)槽

33、，。要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時間，對于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時可墊兩塊硝纖膜，以免轉(zhuǎn)膜過頭。（因為如果第一張膜上蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了，第二張膜上還有蛋白質(zhì)可以進(jìn)行檢測；）對于大分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時電壓要高一點，一般80-100V,時間也要延長一點。特別是務(wù)必注意加強(qiáng)降溫措施。（干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時。負(fù)載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。）WB封閉及雜交封閉：轉(zhuǎn)移后的膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白

34、質(zhì)的進(jìn)一步檢測。將膜用TTBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液（常用脫脂奶粉或5%BSA磷酸化的蛋白一般首選BSA封閉）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h0必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。原理：1 .封閉液中的蛋白填塞入膜孔道，封閉膜上疏水結(jié)合位點即無蛋白轉(zhuǎn)移區(qū)，這樣一抗孵育時起到減輕背景作用；2 .封閉液與抗原結(jié)合只是非特異性結(jié)合膜表面抗原，在一抗孵育情況下大部分可以競爭性的與抗原結(jié)合，而此時的一抗和奶粉對雜帶的作用均為非特異性的作用，所以奶粉封閉后可以減少雜帶的顯色；封閉時

35、間長，條帶變?nèi)?，此時可以延長漂洗和一抗孵育的時間。免疫雜交原理：1）印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。2）處理過的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理。（二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。）處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。3）目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶催化底物生成有顏色

36、的產(chǎn)物時，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。步驟：一抗孵育：1）從封閉液中取出膜，1XTBST5-10minX3次。2）將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度。3）將膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗體，4度孵育過夜。4）次日用1XTBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5-10min。孵育時間：一抗的孵育時間可從幾小時至過夜（一般不超過18小時）不等，取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度，建議使用較高的抗體稀釋倍數(shù)和較長的孵育時間來保證特異性結(jié)合孵育溫度：盡可能低溫孵育，如果在封閉液中孵育一抗過夜，應(yīng)在4度進(jìn)行否則會產(chǎn)生污染而破壞蛋白（降別是磷酸基團(tuán)）。二抗孵育：1.同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與

37、膜接觸，室溫下孵育1h。2,用1XTBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5-10minWB一發(fā)光鑒定原理：經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-澳-4-氯呷咪磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2

38、為底物，將3-氨基-9-乙基咔哇氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯蔡酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾并發(fā)光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在了。步驟：1）將兩種顯色底物1:1等體積混合（一般各1ml）。2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。3）用膠片夾把膜包起來（期間膜不可以干），放入曝光儀中。4）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間和曝光強(qiáng)度，得到最佳結(jié)果，導(dǎo)出并保存問題電泳條帶成笑臉狀電泳條帶成皺眉狀拖尾紋理（縱向條紋）條帶偏斜條帶兩邊擴(kuò)散Marker變黑色雜帶較多可

39、能原因膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統(tǒng)溫度偏圖可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全樣品溶解不好樣品中含有不溶性顆粒電極不平衡或者加樣位置偏斜加樣量過多抗體和Marker蛋白反應(yīng)膜封閉不夠一抗稀釋度不適宜一抗孵育的溫度偏高二抗?jié)舛榷冗^高二抗的非特異性背景二抗孵育時間過久選擇膜的問題膜在實驗過程中干過檢測時曝光時間過長洗膜不充分抗體和封閉蛋白有交叉反應(yīng)目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點，糖基化位點，乙?；稽c等），本身可以呈現(xiàn)多條帶目的蛋白有其他剪切本樣品處理過程中目的蛋白發(fā)生降解上樣量過高，太敏感一抗不純建議減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳調(diào)整裝置樣品充分溶解混勻后上樣樣品充分?jǐn)嚢杌靹蛘{(diào)整電極和加樣適當(dāng)減少上樣量在Marker和sample之間空出一個孔不上樣延長封閉時