淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體的制備及其對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖影響的研究

1、淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體的制備及其對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖影響的研究         10-10-28 14:49:00     作者：付達(dá)華，熊典虹，朱亮    編輯：studa20【摘要】  目的 制備淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體并研究其對(duì)HER2/neu(erbB2)原癌基因過表達(dá)腫瘤細(xì)胞株體外增殖的影響。方法 采用超聲薄膜分散法制備淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體；正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方；HPLC法測(cè)定藥物包封率及脂質(zhì)體中藥物濃度；離心加速實(shí)驗(yàn)及冷藏實(shí)驗(yàn)考察脂質(zhì)體穩(wěn)定性；

2、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；MTT法測(cè)定游離淺藍(lán)菌素及淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果 淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體的平均粒徑為134.3 nm，穩(wěn)定性良好，最佳處方條件下藥物包封率為(53.45±3.67)%，脂質(zhì)體中藥物質(zhì)量濃度為(1.126±0.065) mg/mL，劑量依賴性抑制SKBr3和SKOv3Br3細(xì)胞和SKOv3細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且作用強(qiáng)于游離淺藍(lán)菌素。 【關(guān)鍵詞】  淺藍(lán)菌素 脂質(zhì)體 包封率 腫瘤細(xì)胞 IC50Abstract:Objective To optimize the preparation of cerulenin iposom

3、es and investigate the effect of cerulenin liposomes on proliferation of tumor cells overexpressing HER2/neu in vitro. Methods Cerulenin embedded in liposomes was assayed by HPLC and the embedding rate of cerulenin was calculated. Particle size and distribution of cerulenin liposomes were investigat

4、ed by laser scatter and stability of liposomes was investigated by centrifugal acceleration experiment and deep freezing. The growth curves of cells treated with cerulenin liposomes at different concentrations were determined by counting the cell number and IC50 of cerulenin liposomes was determined

5、 by MTT method. Results The average diameter of cerulenin liposomes was 134.3 nm with good stability. The embedding rate of cerulenin into liposomes was 53.45%, and the concentration of cerulenin in liposomes was 1.126 mg/mL. The liposomes inhibited the growth of SKBr3 and SKOv3 cells in vitro in a

6、dosedependent manner and the IC50 of cerulenin liposomes on SKBr3 and SKOv3 cells was 9.62×10-6 and 9.32×10-6 mol/L respectively. Conclusion The cerulenin liposomes that were prepared with the modified formulation inhibited the proliferation of SKBr3 and SKOv3 cells in vitro with IC50 less

7、 than those of free cerulenin.Key words:Cerulenin; liposomes; embedding rate; tumor cells; IC50近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶(FAS)在多種惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌中呈高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)1，2。FAS的抑制劑淺藍(lán)菌素通過與脂肪酸合成酶復(fù)合體系的酮脂酰ACP合酶末端絲氨酸的SH結(jié)合，形成內(nèi)酰胺從而使FAS失活，但只有HER2/neu(erbB2)原癌基因過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株才對(duì)淺藍(lán)菌素敏感1。    淺藍(lán)菌素(cerulenin, CE)為淺藍(lán)頭孢霉菌的次級(jí)

8、代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)其也可從多種微生物及動(dòng)物組織中分離提取3。除了用于治療肥胖癥外，近幾年還發(fā)現(xiàn)淺藍(lán)菌素具有抗真菌4、抗病毒5、抗癌6等藥理作用，引起了研究者的極大興趣。但該化合物水溶性差（溶解度約為0.3 mg/mL）、毒副作用較強(qiáng)，且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定。研究表明，脂質(zhì)體作為藥物載體可以有效地降低毒副作用，且免疫脂質(zhì)體可以將藥物靶向釋放到靶分子7。本研究制備了淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體(CEL)，對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行考察；并以HER2/neu(erb B2)過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株SKBr3和SKOv3為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，考察CEL對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響。1  材料與方法1.1  儀器與試劑 

9、0;   SHIMADZU LC10ATvp高效液相色譜儀(日本島津)； C18 ODS分析柱(DiamonsilTM, 5 m, 150 mm×4.6 mm，北京迪馬科技有限公司)；REVCO 3000 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)REVCO公司)；Model 312分光光度平板讀數(shù)計(jì)(Biotech Research Laboratories Inc.)；RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BI90型激光粒度分析儀(Brookheven Co., USA)；SIGMA 3K18低溫高速離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；JY250探頭式超聲儀(浙江三門超聲波儀器廠)。&#

10、160;   淺藍(lán)菌素(Sigma Inc., 純度>98)；膽固醇(上海生物化學(xué)試劑公司)；大豆卵磷脂(上海油脂一廠)；MEM培養(yǎng)基(HycloneTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；非必需氨基酸(Amresco Inc., USA)； 胰蛋白酶(Amresco Inc., USA)；甲醇(色譜純，天津南開化學(xué)試劑有限公司)；MTT(Sigma Inc.)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2  細(xì)胞培養(yǎng)    SKBr3乳腺癌細(xì)胞株和 SKOv3

11、 卵巢癌細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所(ATCC number分別為HTB30TM和HTB77TM)。常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、2 mmol·L-1 L谷氨酰的改良MEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：5%CO2、95%濕度、37 。每周傳代2次。待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后，棄去舊培養(yǎng)基，以適量0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(體積比為11)將細(xì)胞消化約1 min，棄去消化液并加入適量含10%FBS的MEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打后制備細(xì)胞懸液，以14的比例傳代。1.3  淺藍(lán)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定     淺藍(lán)菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度分別為0.5、2、10、

12、50、200、1 000 mol·L-1。 HPLC法測(cè)定淺藍(lán)菌素的含量7：DiamonsilTM ODS色譜柱(C18, 150 mm×4.6 mm, 5 m)；流動(dòng)相為乙腈磷酸二氫鉀(10 mmol·L-1,pH 3.0)(體積比4060)；流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為10 L。測(cè)定各濃度下淺藍(lán)菌素峰面積，并以O(shè)riginPro 7.5軟件擬合濃度峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4  淺藍(lán)菌素脂質(zhì)體(CEL)的制備     采用超聲薄膜分散法制備CEL。將一定比例的卵磷脂、膽固醇和淺藍(lán)菌素的

13、三氯甲烷溶液混合后置梨形瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，制成均勻的脂質(zhì)干膜，并以N2吹干殘余有機(jī)溶劑。加入10 mmol·L-1的PBS 5 mL，充N2密封后使脂質(zhì)干膜充分溶脹水化。冰水浴超聲30 min后，探頭式超聲儀超聲整粒3 min。將脂質(zhì)體溶液以0.22 m微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至透析袋中,置100倍體積的生理鹽水中于4 下透析, 12 h后更換介質(zhì)繼續(xù)透析至24 h，以除去游離淺藍(lán)菌素。1.5  處方優(yōu)化     以藥物包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照三因素三水平正交設(shè)計(jì)表(表1和表2)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳處方。表1  因素水平表（

14、略）Table 1  Factors and levels表2  CEL處方優(yōu)化三因素三水平正交試驗(yàn)表（略）Table 1  L9(33) orthogonal design for optimization of CEL formulation1.6  包封率及含量測(cè)定    取透析后的脂質(zhì)體制劑10 L，以甲醇破壞并稀釋1 000倍。取稀釋液10 L，HPLC分析測(cè)定淺藍(lán)菌素峰面積，并代入直線回歸方程計(jì)算藥物濃度，根據(jù)投藥量(投藥量為10 mg)按公式:包封率W內(nèi)/W總×100%計(jì)算藥物包封率。式中，W內(nèi)：包封

15、在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量；W總：投入的藥物總量。1.7  CEL的穩(wěn)定性研究     離心加速實(shí)驗(yàn)：將制得的脂質(zhì)體樣品稀釋后進(jìn)行離心加速實(shí)驗(yàn)9(10 000 r·min-1，30 min)，分光光度法測(cè)定脂質(zhì)體樣品離心前后500 nm處的吸光度變化，根據(jù)公式:KE = (A0-A)/A0計(jì)算穩(wěn)定性參數(shù)。式中，A0: 脂質(zhì)體稀釋液的吸光度；A: 脂質(zhì)體稀釋液離心后的吸光度。    冷藏實(shí)驗(yàn)：將CEL適當(dāng)稀釋后以N2密封于安瓿瓶中，分別儲(chǔ)存于4 的冰箱中及25 的恒溫箱中。分別于第30、60、90天取樣，透析去除滲漏出來(lái)的藥物，HPLC法測(cè)定仍包封在脂質(zhì)體中的藥物含量，按公式:P= (C0-C)/C0×100%計(jì)算滲漏率。式中，C0為冷藏實(shí)驗(yàn)開始前脂質(zhì)體的藥物含量，此處為1.126 mg/mL；C為儲(chǔ)存不同時(shí)間后每毫升脂質(zhì)體中的藥物含