酶的分離純化方法

1、精選文檔酶的分別純化方法摘要 酶的分別純化工作，是酶學爭辯的基礎。一個特定酶的提純往往需要通過很多次小試驗進行摸索，很少有通用的規(guī)律可循。本文從酶原料選擇、酶的分別與純化、酶純度的評價三個方面進行總結，列舉了一些常用的分別純化方法。關鍵詞 酶、分別純化、方法、純度中圖分類號 O6 酶的分別純化工作，是酶學爭辯的基礎。一個特定酶的提純往往需要通過很多次小試驗進行摸索，很少有通用的規(guī)律可循。酶的純化過程與一般的蛋白質純化過程相比，又有其本身獨有的特點：一是酶一般取自生物細胞，而特定的一種酶在細胞中的含量很少；二是酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤，前者給純化帶來了困難，而后者卻能使我們快速找出純化過

2、程的關鍵所在。1 酶原料選擇 提取某一種酶時，首先應當依據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。但是由于從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多接受培育微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產酶制劑的優(yōu)點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產量，用廉價原料可以大量生產。2 酶的分別純化由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有很多其它酶和一般蛋白質以及其他雜質，因此為制取某酶制劑時，必需

3、經過分純化的手續(xù)。酶是具有催化活性的蛋白質，蛋白質很簡潔變性，所以在酶的提純過程中應避開用強酸強堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較簡潔跟蹤酶在分別提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分別純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分別純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而打算著一步驟的取舍。酶的分別純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不行避開地夾帶著一些雜質，然后再將此酶從溶液中選擇性地分別出來，或者從今溶液中選擇性地除去雜質，然后制成

4、純化的酶制劑。下面就酶的分別純化的常用方法作一綜合介紹。2.1 預處理及固液分別 2.1.1 細胞裂開（cell disruption）高壓均質器法：此法可用于裂開酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉到低壓環(huán)境，細胞就簡潔裂開。菌懸液一次通過均質器的細胞裂開率12%-67%。細胞裂開率與細胞的種類有關。要達到90%以上的細胞裂開率，起碼要將菌懸液通過均質器兩次。最好是提高操作壓力，削減操作次數(shù)。但有人報道，當操作壓力達到175Mpa時，裂開率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞裂開率上升較為緩慢。高壓均質器的閥門是影

5、響細胞裂開率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培育基上比在合成培育基上生長的大腸菌更難裂開。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格廉價，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（干重），在35用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內蛋白質除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分數(shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。2.1.2 離心離心分別過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分別3種

6、類型，所使用的設備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用于分別固體濃度較低的固液分別，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質等。分別機用于分別兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領域接受的離心機系統(tǒng)，除了應具備離心機的一般要求外，還應滿足生物生產的技術要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產品不受污染并不污染環(huán)境?，F(xiàn)代哦離心機裝置包括以下三個步驟，并進行程序把握：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產品的裝置，具有雙重軸

7、向密封，密封由裝在轉筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防止產品被污染，也可防止生產過程中排出的廢物對環(huán)境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設備設有環(huán)繞離心機轉筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，并能有效地把握溫度，這對于生物制品是格外重要的。如BTPX205型離心機可用于細胞收集、培育液的凈化和細胞碎片的分別，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他幫助系統(tǒng)及把握系統(tǒng)也較為完善，如設有壓力指示器、力氣計、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?.1.3 膜分別技術在蛋白質純化過程中主要用到的膜分別技術多為超濾。在靜壓作用下

8、降溶液通過孔徑格外小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層格外薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜打算了膜的孔徑，而支撐膜供應機械強度以抵制靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點是：操作條件溫存，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當料液濃縮至肯定的倍數(shù)后即可作為進一步處理的濃縮料液。超濾應用于蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應留意以下問題：第一，在超濾循環(huán)過程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的

9、溫度會漸漸上升，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動測溫及把握系統(tǒng)。其次，某些酶的幫助因子散失為問題：一些酶含有幫助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排解掉，因而在超濾前或超濾后要添加肯定濃度的的幫助因子。還可將超濾與親和層析相結合以提高分別純度。其工作原理是：當溶液中欲被分別的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，假如在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用于進一步的分別純化。2.1.4 泡沫分別原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活

10、性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分別。 蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利于其結構的穩(wěn)定。泡沫分別過程是：蛋白質從主體溶液中集中到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不行逆的；分子發(fā)生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發(fā)生由多個分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。泡沫分別的目的，一方面提高酶蛋白的富

11、集率（泡沫中蛋白質的濃度/最初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/最初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的安排系數(shù)最大。2.2 抽提沉淀 2.2.1 鹽析常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格廉價。硫酸銨沉淀蛋白質的力量很強，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質沉淀下來。對酶沒有破壞作用。pH的把握：應從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等電點時穩(wěn)定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調整好酶液的pH值，要盡量避

12、開溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時要留意攪拌，并留意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。溫度的把握：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉淀下來，酶靜置后，就不要再加以攪拌。2.2.2 有機溶劑沉淀有機溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。有機溶劑沉淀操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成永久失活。因此

13、用有機溶劑處理時最好在0以下進行。用有機溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。2.2.3 聚合物絮凝劑沉淀聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩(wěn)定還有肯定的愛護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。2.2.4 用金屬離子和絡合物沉淀酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的金屬離子會催化酶變性而失

14、活。2.2.5 用特殊試劑沉淀法用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉淀出來。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。2.2.6 親和沉淀將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機結合形成了親和沉淀技術。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結合后在肯定條件下可以沉淀出來。配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質濃度等條件對親和結合的影響力并不大，只有競爭性的配基會降低產物與原配基的親和結合力，甚至使親和結合發(fā)生逆轉。引導產生沉淀的方法有：離子交

15、聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；轉變pH值，誘導產生疏水沉淀；溫度誘導產生沉淀。親和結合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質的溶液中，調整好有關沉淀的條件，使之有利于親和結合。洗滌：為經過處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會發(fā)生非特異性結合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應將使其他蛋白質共同沉淀，因此在分別目的物之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋?，再沉淀；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉淀。在上述過程中要始終保持目的蛋白質與配基處于親和結合狀態(tài)。配基-載體復合物與目的蛋白質的分別：分別結束之后，要確保回收目的蛋白質和配基-載體復合物，目的蛋白質要達到肯

16、定的純度，回收率要高。3 酶純度的評價酶純化的目標是使酶制劑具有最大的催化活性和最高純度，檢驗這些指標的方法主要有電泳法、活性染色法、等電聚集法、超速離心法、抗原-抗體免疫法等。檢測純化酶的催化活性時，要使測定條件下在最適狀態(tài)。如測定體系中有足夠的激活劑和輔因子，無抑制劑等，還需搞清酶在什么條件下保存較為穩(wěn)定。在有些狀況下需要加入一些還原劑，如二硫蘇糖醇、羥基乙醇，以保證半胱氨酸側鏈巰基處于還原態(tài)。在低溫貯存酶時，可將酶在50%的甘油保存，以削減酶失活。假如酶制劑用前面介紹的方法分析達到均一，仍有可能其中有部分酶已經失活，一般可用“活性部位滴定”技術測定活性酶的含量。參考文獻1袁勤生.現(xiàn)代酶學

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