臨床免疫實(shí)驗(yàn)2

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（操作一）一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（操作一）MTT法法二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（操作一）二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（操作一） ELISA（雙夾心法）法檢測(cè)乙肝表面（雙夾心法）法檢測(cè)乙肝表面抗原（抗原（HBsAg） 一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（ MTT法操作一）法操作一）n原理原理n方法方法n結(jié)果結(jié)果n應(yīng)用應(yīng)用MTT法法四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法 原理：原理：T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原刺激下，發(fā)淋巴細(xì)胞在有絲分裂原刺激下，發(fā)生有絲分裂，形成淋巴母細(xì)胞。其蛋白質(zhì)合成生有絲分裂，形成淋巴母細(xì)胞。其蛋白質(zhì)

2、合成與與DNA合成及代謝比正常細(xì)胞旺盛，活細(xì)胞線合成及代謝比正常細(xì)胞旺盛，活細(xì)胞線粒體中某些酶可將粒體中某些酶可將MTT還原為藍(lán)黑色甲臜用還原為藍(lán)黑色甲臜用溶解甲臜，在溶解甲臜，在nm處測(cè)值，處測(cè)值，能夠反映淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化程度能夠反映淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化程度MTT法值對(duì)照管值刺激管ODODConASI MTT-四甲基偶氮唑鹽絲裂原絲裂原MouseHumanTBTBConA+-PHA+-+-PWN+/-LPS-+-SpA-+實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟無(wú)菌取1/2的脾研磨成單細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)(40)96孔培養(yǎng)加板(三復(fù)孔)調(diào)細(xì)胞濃度1107/ml5%CO2 37培養(yǎng)44小時(shí)加入加入MTT (5mg/ml)

3、 10ul/well5% CO2 37 繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)小時(shí)輕輕吸去上清，輕輕吸去上清，加加DMSO，溶解甲臜顆粒，溶解甲臜顆粒A570nmELISA plate reader 實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度ConADay 1Day 3注意事項(xiàng)注意事項(xiàng):n由于本實(shí)驗(yàn)需要培養(yǎng)由于本實(shí)驗(yàn)需要培養(yǎng)3天，才能觀察結(jié)果。天，才能觀察結(jié)果。因此，在操作時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免因此，在操作時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免細(xì)菌污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。細(xì)菌污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：(本次課完成本次課完成)n1、制備脾細(xì)胞懸液、制備脾細(xì)胞懸液n1）取脾）取脾：用用1000ul加樣器加樣器取取5ml 培養(yǎng)液放入平皿中培

4、養(yǎng)液放入平皿中.頸部脫頸部脫臼處死小鼠，酒精消毒，無(wú)菌取脾臟，用毛玻璃片磨碎，放在臼處死小鼠，酒精消毒，無(wú)菌取脾臟，用毛玻璃片磨碎，放在平皿中，隔著紗布吸出細(xì)胞懸液放入離心管中，離心平皿中，隔著紗布吸出細(xì)胞懸液放入離心管中，離心1500r/min,20min。棄去上清。棄去上清,加入加入3mlIMDM培養(yǎng)液，混勻。培養(yǎng)液，混勻。n2）細(xì)胞計(jì)數(shù)：）細(xì)胞計(jì)數(shù)： 取取0.2ml 放入一試管中放入一試管中, 加入加入1.8ml細(xì)胞計(jì)數(shù)液。細(xì)胞計(jì)數(shù)液。取取20m ml填充細(xì)胞計(jì)數(shù)板填充細(xì)胞計(jì)數(shù)板, 顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法。n 3）調(diào)細(xì)胞濃度到）調(diào)細(xì)胞濃度到510/ml ：如配制如配

5、制10mL稀釋細(xì)胞懸液稀釋細(xì)胞懸液:從細(xì)胞懸液中取從細(xì)胞懸液中取(2000/X)mL至試管至試管, 加入培養(yǎng)液至加入培養(yǎng)液至10 ml即即可?？?。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)方法l 查出四個(gè)16個(gè)大方格的總細(xì)胞數(shù)(X)l 算出每個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)：Y=X4l 每個(gè)大方格的體積為V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4mll 制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（A/ml)=Y 104稀釋倍數(shù)(10)4實(shí)驗(yàn)步驟（本次課完成）實(shí)驗(yàn)步驟（本次課完成）2、加、加 板板n每孔加入每孔加入100m ml的調(diào)好的細(xì)胞懸液的調(diào)好的細(xì)胞懸液n1-3孔孔(對(duì)照對(duì)照)加入加入10%FCS-IMDM 100m ml n4-6孔加

6、入孔加入20m mg/ml的的ConA 100m mln7-9孔加入孔加入10m mg/ml的的ConA 100m mln10-12孔加入孔加入5m mg/ml的的ConA 100m mln3、細(xì)胞培養(yǎng)：、細(xì)胞培養(yǎng)：5% CO2 孵箱內(nèi)孵箱內(nèi)37培養(yǎng)培養(yǎng)48h。n4、MTT摻入摻入：在終止培養(yǎng)前：在終止培養(yǎng)前4小時(shí)（培養(yǎng)小時(shí)（培養(yǎng)44小時(shí)）加入小時(shí)）加入MTT (5mg/ml)10m ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，至孔，繼續(xù)培養(yǎng)，至48小時(shí)終止培小時(shí)終止培養(yǎng)養(yǎng)(此步驟由實(shí)驗(yàn)小組長(zhǎng)完成此步驟由實(shí)驗(yàn)小組長(zhǎng)完成 )。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：(下次課完成下次課完成)n5、結(jié)果測(cè)定：、結(jié)果測(cè)定：棄上清，加入棄上清，加

7、入DMSO (100m ml/孔孔)，振，振蕩溶解甲蕩溶解甲臢顆粒。臢顆粒。充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度值。值。OD570nm。100%未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)化率形態(tài)學(xué)n淋巴母細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的表現(xiàn)主要有體積明顯增大，是成熟淋巴淋巴母細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的表現(xiàn)主要有體積明顯增大，是成熟淋巴細(xì)胞的細(xì)胞的34倍；染色質(zhì)疏松，核仁清晰可見(jiàn)；胞漿豐富并形成空倍；染色質(zhì)疏松，核仁清晰可見(jiàn)；胞漿豐富并形成空泡。泡。n根據(jù)細(xì)胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及根據(jù)細(xì)胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及有無(wú)核仁等特征，分別計(jì)數(shù)淋

8、巴母細(xì)胞、過(guò)渡型母細(xì)胞和核絲分有無(wú)核仁等特征，分別計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞、過(guò)渡型母細(xì)胞和核絲分裂相細(xì)胞以及成熟的小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，每份標(biāo)裂相細(xì)胞以及成熟的小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：個(gè)細(xì)胞，按下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率： 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用n檢查患者細(xì)胞免疫功能檢查患者細(xì)胞免疫功能n估計(jì)疾病的療效及預(yù)后估計(jì)疾病的療效及預(yù)后n細(xì)胞配型抗原的檢查：移植免疫細(xì)胞配型抗原的檢查：移植免疫M(jìn)LRn免疫藥理學(xué)：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥免疫藥理學(xué)：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥及生物制品及生物制品n衛(wèi)生毒理學(xué)的研究衛(wèi)生毒

9、理學(xué)的研究二、二、ELISA（雙夾心法）法（雙夾心法）法檢測(cè)乙肝表面抗原（檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg） 【目的】【目的】1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理。掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理。2.熟悉熟悉ELISA的基本類型和用途。的基本類型和用途。3.掌握用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗夾心法檢測(cè)掌握用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗夾心法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原的方法。乙型肝炎表面抗原的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】n先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗體；加入待檢標(biāo)本，充分作用后，標(biāo)本中相應(yīng)體；加入待檢標(biāo)本，充分作用后，標(biāo)本中相應(yīng)的抗原與固相上已知抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的的抗原與固

10、相上已知抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗原成分；加入已知的酶標(biāo)抗體，再洗去未結(jié)抗原成分；加入已知的酶標(biāo)抗體，再洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；加底物后，酶分解底物產(chǎn)生呈合的酶標(biāo)抗體；加底物后，酶分解底物產(chǎn)生呈色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺判定待檢標(biāo)本中抗原色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺判定待檢標(biāo)本中抗原的量。的量。固相載體n最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性來(lái)的免疫學(xué)活性 。Enzymen常用的酶常用的酶n辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(horseradish perox

11、idase, HRP)。n堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)。n葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶半乳糖苷酶和脲酶等。等。 HRP的底物n 鄰苯二胺鄰苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)n四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine, TMB)OPDnOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。結(jié)合物最常用的底物。nOPD本身難

12、溶于水，本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。為水溶性。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。nOPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色黃色 返回返回Application of ELISAn目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，常用目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，常用來(lái)檢測(cè)機(jī)體的可溶性的抗原或抗體。來(lái)檢測(cè)機(jī)體的可溶性的抗原或抗體。n敏感性高，可檢測(cè)微量的的抗體體或激素、細(xì)敏感性高，可檢測(cè)微量的的抗體體或激素、細(xì)胞因子及粘附分子等抗原性物質(zhì)。胞因子及粘附分

13、子等抗原性物質(zhì)。n成品的試劑盒，已廣泛用于某些臨床疾病的診成品的試劑盒，已廣泛用于某些臨床疾病的診斷。斷。返回返回常用的常用的ELISAELISA方法方法n直接法直接法 (n間接法間接法 (n夾心法夾心法 (直接法直接法間接法間接法夾心法夾心法n【材料與試劑】【材料與試劑】n1材料：材料：n酶標(biāo)板（酶標(biāo)板（96孔）、微量加樣器、酶標(biāo)檢測(cè)儀、濕盒、水浴箱，孔）、微量加樣器、酶標(biāo)檢測(cè)儀、濕盒、水浴箱，43培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱n2試劑：試劑：n1）包被抗體：抗）包被抗體：抗HBs(用包被緩沖液稀釋用包被緩沖液稀釋2ug/ml)n2）酶標(biāo)抗體（）酶標(biāo)抗體（HRP抗抗HBs,用洗滌液稀釋用洗滌液稀釋1:300）

14、n3）HbsAg表面抗原（乙肝疫苗表面抗原（乙肝疫苗,用樣本稀釋液稀釋用樣本稀釋液稀釋1600ng/ml即即1.6ug/ml）n4）模擬待檢樣品（）模擬待檢樣品（HBsAg疫苗疫苗,用樣本稀釋液稀釋用樣本稀釋液稀釋400ng/ml即即0.4ug/ml）n5）包被緩沖液）包被緩沖液pH9.6 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液。碳酸鹽緩沖液。 n6）洗滌液）洗滌液 0.01M pH7.4 PBS 含含0.1% Tween20（不含任何防腐劑）。（不含任何防腐劑）。n7）封閉液）封閉液 ： 0.01mol/L、PH7.4PBS內(nèi)含內(nèi)含1% BSA,。n8）樣品稀釋液）樣品稀釋液 含含0.25% BSA

15、-洗滌液。洗滌液。n9）底物緩沖液（）底物緩沖液（pH5.0） 0.2M Na2HPO4 25.75ml+0.1M檸檬酸檸檬酸24.25ml+30% H2O2 100l。n10）底物溶液）底物溶液 鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)1mg/ml 溶于底物緩沖液中，臨用前配制。溶于底物緩沖液中，臨用前配制。n11）終止液）終止液 2mol/L H2SO4（22ml濃濃H2SO4+178ml dH2O）。）。n【實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)】【實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)】2.5學(xué)時(shí)，分兩次課完成。學(xué)時(shí)，分兩次課完成。n【實(shí)驗(yàn)步驟】【實(shí)驗(yàn)步驟】n第一次操作，用時(shí)第一次操作，用時(shí)25分鐘分鐘n1、抗體包被：、抗體包被：用包被液將抗用包被液將抗HB

16、s稀稀釋至適當(dāng)濃度（釋至適當(dāng)濃度（2ug/ml），酶標(biāo)板），酶標(biāo)板中中110孔每孔加孔每孔加100l，1112做做空白對(duì)照（不加樣）空白對(duì)照（不加樣）,將反應(yīng)板移至溫將反應(yīng)板移至溫盒內(nèi)，盒內(nèi)，4放置過(guò)夜（可保存一周，放置過(guò)夜（可保存一周，下次課后續(xù)操作）。下次課后續(xù)操作）。第二次操作，下次課完成，用時(shí)第二次操作，下次課完成，用時(shí)100分鐘分鐘n2、封閉：、封閉：棄去包被液，每孔加入棄去包被液，每孔加入200ul封閉液，封閉液，1112孔空白對(duì)照孔空白對(duì)照,置置43 溫箱溫箱20min。n3、洗滌：、洗滌：棄去包被板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿棄去包被板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿110孔，靜置孔，靜置13

17、min后后甩干，洗滌甩干，洗滌1次，于吸水紙上拍干。次，于吸水紙上拍干。n4、加樣：、加樣：1-2、4-8每孔加樣品稀釋液每孔加樣品稀釋液100l，3、4孔加孔加1.6ug/ml HbsAg表面抗原，表面抗原，100ul/孔，自第孔，自第4孔混勻后吸出孔混勻后吸出100ul加入第加入第5孔，以此孔，以此方法對(duì)倍稀釋至方法對(duì)倍稀釋至8孔孔,吸出吸出100ul棄之棄之,910孔加入待檢樣品孔加入待檢樣品100ul/孔孔,輕輕輕輕振動(dòng)混勻置于振動(dòng)混勻置于4320min，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次次，每次13分鐘分鐘,拍干。拍干。n5、加酶標(biāo)抗體、加酶標(biāo)抗體：每孔加：每孔加HRP抗抗HBs100l（空白孔不加），置于（空白孔不加），置于 4320min，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次次，每次1