探究墨角藻調(diào)雌性SD大鼠和人卵巢黃素化顆粒細胞內(nèi)分泌激素的作用機理

1、探究墨角藻對雌性SD大鼠和人卵巢黃素化顆粒細胞內(nèi)分泌激素的影響摘要：流行病學研究報告表明：典型的亞洲膳食人群跟西方膳食人群相比有較低的激素依賴性癌癥發(fā)病率這些膳食上的差別使得亞洲人攝取了更多的大豆。然而我們實驗室的研究結(jié)果表明：海帶的抗雌激素作用可能同樣有利于減少癌癥的發(fā)病率。以下針對絕經(jīng)前女性做的海帶攝入量跟內(nèi)分泌調(diào)節(jié)之間的相關關系實驗，我們研究了海帶（墨角藻）對雌性大鼠和人卵巢黃素化顆粒細胞(hLGC)的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。海帶會影響大鼠的發(fā)情周期：175mg·kg-1wt·d-1(P=0.05)4.3±0.96d5.4±1.7d；350mg·

2、kg-1wt·d-1(P=0.002)5.9±1.9d,并且100%延長了大鼠的發(fā)情周期(P=0.02)。按照175mg·kg-1wt·d-1的劑量喂養(yǎng)大鼠兩周，17-雌二醇水平從48.9±4.5下降到40.2±3.2ng/L(P=0.13).四周后，17-雌二醇水平下降到36.7±2.2ng/L(P=0.02)。卵巢黃素化顆粒細胞,23,50以及75µmol/L劑量分別使17-雌二醇水平從4732±591下降到3632±758,3313±373，3060±538ng/L。海

3、帶攝入量同樣能提升卵巢黃素化顆粒細胞培育孕激素的水平。海帶提取物的IC值分別為42.4,31.8和40.7時能抑制雌激素和雌激素受體和，孕激素和孕激素受體之間的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明海帶的內(nèi)分泌調(diào)劑作用根基量有關，并且表明膳食中含較多海帶是日本地區(qū)激素依賴性疾病發(fā)病率如此之少的原因。關鍵字：墨角藻；大鼠；海帶；乳腺癌；內(nèi)分泌美國的激素依賴性癌癥發(fā)病率逐年上漲，我們在預防這些癌癥上取得的微不足道的成果都讓我們對日本的膳食越來越感興趣，因為日本是世界上乳腺癌、子宮癌、卵巢癌發(fā)病率最低的國家之一。研究調(diào)查結(jié)果顯示，日本女性跟一同參加測試的西方女性相比，有較長的生理周期和較低的血清雌二醇水平，這些都可能是

4、她們面臨較低的激素依賴性癌癥威脅的原因。到目前為止，亞洲人群中部分天生偏向選擇富含大豆膳食有利于降低這些癌癥的發(fā)病率。然而，Teas等人之前的假設是另一個有利因素可能是他們較高的海帶攝入量。在人體實驗中，我們研究了墨角藻攝入量顯著增加了生理周期的天數(shù)，減少了循環(huán)中的17-雌二醇水平，并且提升絕經(jīng)前有異常生理周期史的女性的血清孕酮水平?，F(xiàn)階段的研究中，我們深入研究了在大鼠和人體內(nèi)墨角藻調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素對性激素和循環(huán)系統(tǒng)的作用。之前有研究表明，生理周期長度跟乳腺癌、子宮癌、卵巢癌之間有反相關關系。生理周期長度，月經(jīng)初潮時的年齡以及孕激素都可以作為反映內(nèi)源性雌二醇和更年期年齡的指標。生理周期較短的女性

5、跟生理周期較長的女性相比嗎，在她們的整個生殖周期中會有較多的月經(jīng)次數(shù)。因此，那些女性就會在生殖周期中花費更多的時間在產(chǎn)生卵泡和黃體階段，這個階段中雌激素和孕激素水平，子宮內(nèi)膜和乳腺細胞都是處在最高的增殖率。也曾有報道指出，乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、肥胖、酒精攝入量這些因素跟持續(xù)刺激雌激素以及性激素失衡之間都有正相關關系。那些實驗研究表明，暴露的雌激素，雌激素和孕酮的的比例失衡可能是雌激素依賴型疾病最至關重要的影響因素。在預防一些雌激素依賴性疾病的治療過程，還有高危個體的防御措施中，現(xiàn)階段主要的策略就是阻止雌激素通過雌激素受體或者封鎖芳香化酶。進一步的措施是，識別發(fā)揮化學保護作用抑制內(nèi)源性雌激素產(chǎn)

6、生的膳食成分，這也許可能降低乳腺癌、子宮癌、卵巢癌額發(fā)病率。利用大鼠和人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細胞檢測化學性內(nèi)分泌干擾物用來降低癌癥威脅。以雌性SD大鼠為實驗對象來研究內(nèi)分泌調(diào)節(jié)對乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌作為模板參考。因為人和大鼠的卵巢分泌荷爾蒙具有相似性，所以一般用大鼠模型測試化學性內(nèi)分泌干擾物。大鼠的發(fā)情期和人的生理周期中，雌二醇水平在發(fā)情期前和產(chǎn)卵期時達到峰值，孕激素水平在發(fā)情期和產(chǎn)黃體期時達到峰值。人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細胞顯著的刺激了黃體的產(chǎn)生，因為它們支持及時的在循環(huán)中動態(tài)選擇雌二醇和孕激素，在生理周期中的黃體期模擬血清激素水平。卵巢黃素化顆粒細胞培養(yǎng)成功應用到研究化學性內(nèi)分泌

7、干擾物，比如說二噁英對卵巢雌激素和孕激素合成的作用。我們本次實驗的目的就是建立起我們之前研究的實驗模型：1)檢測膳食中控制墨角藻的攝入量是否會擾亂SD大鼠正常的發(fā)情周期和性激素的分泌2)利用墨角藻的提取物培養(yǎng)人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細胞以研究顆粒細胞中的激素反映。為了進一步深入研究墨角藻提取物對對雌激素和孕激素的反映，我們評價它的結(jié)合雌激素受體、，孕激素受體親和力，以及它在培養(yǎng)人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細胞中潛在的阻止芳香化酶活力的作用。材料和方法大鼠及其發(fā)情周期的檢測24只重量200-250g的成年雌性SD大鼠，安置它們獨自在鐵絲籠中。它們被允許自由采用實驗室標準的膳食和水。經(jīng)過2周簡短的調(diào)整

8、期，老鼠經(jīng)過每天的陰道細胞學檢測以用分期標準確定正常的發(fā)情周期。老師在實驗前必須確保至少有兩次連續(xù)的發(fā)情周期。一個正常的發(fā)情周期被確定為35天。一個完整的發(fā)情周期被認為是第一次發(fā)情到第二次發(fā)情之間的間隔。在試驗期間每周檢測一次老鼠的重量。墨角藻的來源和劑量來自緬因州海岸的海水蔬菜市場的墨角藻干燥后，研磨成粉末狀。海帶是去年夏天從緬因灣、新不倫瑞克、新斯科舍收割來的。加工過程需要太陽曬干除根部以外的整個植體。干燥的海帶之后經(jīng)軋機制成粉末。劑量水平的有效范圍是根據(jù)之前的人類研究報告和傳統(tǒng)的亞洲人膳食決定的，考慮到老鼠實驗需要更大的劑量以增加老鼠新陳代謝速率來和人體實驗進行比較。本實驗獲得了倫理批準

9、并且所有的實驗都符合美國伯克利動物保健中心和行政委員會的標準。海帶的實驗劑量(實驗1) 大鼠被隨機分為三組，每組八只：一支賦形劑，一次低劑量(175mg·kg-1wt·d-1)，一次高劑量(350mg·kg-1wt·d-1)。墨角藻測量后注射入大鼠每天膳食的2g蘋果中。使用蘋果作為媒介有兩個好處：(1)避免了因灌腸產(chǎn)生的緊張；(2)大鼠在攝入蘋果的同時攝入了墨角藻，容易檢測和確保墨角藻的攝入。制作陰道涂片并且每天記錄檢測發(fā)情周期的日志。四周后，所有大鼠恢復正常飲食。實驗期間大鼠沒有出現(xiàn)任何不良反應。時間過程實驗(實驗2)在早晨發(fā)情(由陰道細胞學檢查得知)

10、的19只處于正常發(fā)情周期的大鼠的尾靜脈中抽取1 ml血液在血清激素實驗中觀察性激素是否隨著時間的遷移而發(fā)生改變。抽血之后立即注射175mg·kg-1wt·d-1墨角藻。兩到四周間，再次抽取早晨發(fā)情大鼠的血液。血液樣本在室溫下凝結(jié)成塊，2000×g.的速度下離心處理10min。血清抽濾后在-20冷凍保藏用作后續(xù)分析時使用。高劑量實驗(實驗3)為了研究海帶膳食在大鼠體內(nèi)是否能使雌二醇達到較高的水平，發(fā)揮抗雌激素或孕激素的作用，選中8只雌激素水平50µg/L的大鼠。在早晨發(fā)情期的基礎抽血后給大鼠注射350mg·kg-1wt·d-1(P=0.

11、002)5.9±1.9d。一周膳食后，在大鼠早晨發(fā)情時進行另一次抽血。動物性激素檢測根據(jù)實驗室診斷系統(tǒng)，按照操作規(guī)范使用ELISA試劑盒(No.DSL-10-6800)分三次測量血清孕激素。根據(jù)上文所述方法，使用放射免疫抗體檢測重復檢測17-雌二醇。天然海藻提取物將干燥，粉末狀的墨角藻(50g)放入蒸餾水和乙醇以1:1的比列混合的溶液中，墨角藻完全沉浸在溶液中，在室溫下攪拌24h。提取物在4500×g的速度下離心處理10min，進行無菌過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干燥，在50%的乙醇溶液中重新溶解干燥物。天然海帶提取物的分子量估計是300g/mol，這是一種制藥行業(yè)測定未知生

12、物活性的植物組成常用的方法。hlGC培養(yǎng)和劑量從8位在生育中心接受輔助生育治療的女性體內(nèi)獲得顆粒細胞。對每位患者的細胞進行預處理，制片，培養(yǎng)。簡而言之，顆粒細胞在含有0.1U/mL絨毛膜促性腺激素,抗生素，5%胎牛血清的基本培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。48h后，細胞在乙醇溶液或25,50,75mmol/L海藻提取物中連續(xù)處理9d。最后一天的樣本用來檢測17-雌二醇和孕激素。顆粒細胞激素的檢測 參照前文所述方法使用RIA商用檢測儀(診斷產(chǎn)品)雌二醇和孕激素。雌二醇和孕激素受體結(jié)合檢測 海藻提取物對ER，ER和PR-B的親和力由前文提及的輻射競爭性結(jié)合實驗決定的。簡而言之，3種濃度的干燥海藻提取物稀釋液(0.5

13、,5,50µmol/L)重新溶解在二甲基亞砜，與ER，ER，0.5nmol/L雌二醇溶液中，25下攪拌2h。在加入1µmol/L己烯雌酚的情況下可能存在非特異性結(jié)合。為了檢測到PR-B結(jié)合，海藻提取物用PR-B和1.4nmol/L放射性標記的孕激素在4下處理2。加入1µmol/L孕激素的情況下可能存在特異性結(jié)合。用氚水總成檢測芳香化酶活性通過上文提及的在3H2O摻入含氚的雄烯二酮來測定芳香化酶活性。在含有300 nmol/L的雄烯二酮(10%,90%)的500µL MEM中培育hlGC細胞，37下處理2h，觀察海藻提取物存在和不存在的兩種情況(10,50

14、,100µmol/L)。數(shù)據(jù)分析 在動物實驗1中，3組不同方法之間的差別可以通過兩種方差分析估算。成對比較程序被用來估計膳食治療組和膳食控制組兩組之間的差別。對于所有其他的實驗來說，使用商用數(shù)據(jù)分析軟件分析組與組之間的差別，數(shù)據(jù)分析的結(jié)果P<0.05被認為較好。對于放射性配體結(jié)合檢測來說，IC50是用數(shù)據(jù)分析工具箱的非線性最小二乘法回歸分析確定的。結(jié)論動物實驗海帶的實驗劑量(實驗1)30天內(nèi)每天都估算24只成年雌性SD大鼠的發(fā)情周期。大鼠膳食中含有175，350mg·kg-1·d-1(P=0.004)的海藻提取物的實驗組結(jié)果表明，大鼠的發(fā)情周期隨海藻提取物劑

15、量的增大而增長。在空白對照組中，大鼠發(fā)情周期為4.3±0.96，,175mg·kg-1·d-1(P=0.05)劑量組中大鼠發(fā)情周期為5.4±1.7，350mg·kg-1·d-1(P=0.002)，劑量組中大鼠發(fā)情周期為5.9±1.9。深入研究得出，海帶治療100%顯著增加了動情周期的發(fā)情時間長度(P=0.002)。具體地說，動情周期的平均值為空白對照組0.97±0.22，175mg·kg-1·d-1(P=0.05)劑量組的平均值為1.4±0.54，350mg·kg-1

16、3;d-1,劑量組(P=0.002)的平均值為2.1±0.88.海帶治療對發(fā)情前期和發(fā)情后期的天數(shù)沒有顯著影響。檢測到0,175，350mg·kg-1·d-1,劑量組的整個動情周期的天數(shù)分別為28.6±3.1,30.5±3.6,31.9±3.6。根據(jù)實驗1可知，出去實驗剩余的之外，5只大鼠停止了正常的發(fā)情周期。1只大鼠在發(fā)情期，4只大鼠在動情期。對雌二醇血清和孕激素水平的影響(動物實驗2)175mg·kg-1·d-1的劑量持續(xù)兩周，17-雌二醇水平的平均值從48.9±4.5降低到40.2±3.2

17、ng/L(P=0.13),四周后同樣的劑量水平只有36.7±2.2ng/L(P=0.02)比基本值降低了25%，表明隨著時間的推移劑量的作用越來越顯著?？瞻讓φ战M和治療組的血清孕激素水平?jīng)]有明顯的差別。高劑量實驗（動物實驗3） 海帶膳食治療（350mg·kg-1·d-1）一周后，在高血清17-雌二醇水平的8只大鼠中，血清17-雌二醇水平下降了38%(P=0.02)(數(shù)據(jù)1)。6只大鼠的血清17-雌二醇水平還原范圍為25-58%，其中有2只大鼠對海帶沒有反映。孕激素水平在高劑量的作用下沒有明顯變化。海帶對人卵巢黃素化顆粒細胞的17-雌二醇和孕激素水平的水平 在hlG

18、C細胞的培養(yǎng)中，50,75µmol/L劑量明顯減少了30-35%的17-雌二醇水平。海帶治療同時濕度提高了hlGC細胞中孕激素的水平，然而，只有50µmol/L的劑量能提升(P=0.03)。放射性配體檢測在放射配體競爭性結(jié)合檢測中，海藻提取物發(fā)揮了對雌二醇和ER，ER及ER-結(jié)合，孕激素和PR-B結(jié)合的阻礙作用。這些數(shù)據(jù)顯示，提取物競爭性的結(jié)合ER，ER和PR-B，其中對ER的親和力最高。hlGC加入海藻提取物后芳香化酶的活性沒有明顯變化(數(shù)據(jù)沒有顯示)。討論本文我們通過監(jiān)控大鼠的發(fā)情周期以及性激素水平還有hlGC細胞培養(yǎng)中雌二醇的產(chǎn)量，提出了額外能表明墨角藻具有抗雌激素的

19、生物學作用的證據(jù)。具體地說，海帶膳食在劑量控制的情況下整體提高了37%大鼠的發(fā)情周期，350mg·kg-1·d-1劑量組明顯延長了大鼠的動情周期。海帶膳食控制同時在大鼠雌激素產(chǎn)量方面還發(fā)揮了顯而易見的作用，導致循環(huán)中17-雌二醇水下降了18-33%。這些數(shù)據(jù)一致表明，我們能夠觀察遵循海帶膳食治療的女性到生理周期的延長，雌二醇水平的下降。深入討論，本實驗所用的劑量都是生物相關劑量，和日本人群攝取范圍3-13g/d一致。先前的實驗表明大豆和染料以黃酮對大鼠發(fā)情周期沒有顯著影響，只延長了10%的生理周期。跟大豆相比，海帶在發(fā)揮延長生理周期起更重要的作用。在hlGC生物測定試驗中深

20、入研究了墨角藻的抗雌性激素生理活性，墨角藻提取物導致細胞培養(yǎng)過程中17-雌二醇水平下降了23-35%。這表明提取物同時具有抗雌性激素產(chǎn)生，增加其生物分解速率的作用。競爭性抑制，改變表達基因，翻譯后修飾P450細胞色素酶成類固醇或者進入17-雌二醇新陳代謝影響雌激素水平。然而，我們沒有發(fā)現(xiàn)海帶提取物有對芳香化酶的活性有抑制作用，被認為是一個植物成分發(fā)揮抑制酶活性作用的潛在分子靶點。更深一步研究海帶提取物抑制hlGC培養(yǎng)過程中產(chǎn)生雌激素的實驗仍在繼續(xù)。另一個潛在的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制就是競爭性抑制性激素受體。海帶提取物就像是一個雌二醇結(jié)合ER，ER的結(jié)合競爭阻礙劑，對ER選擇性抑制力遠大于ER。這些數(shù)據(jù)

21、表明墨角藻中的成分能夠通過降低雌二醇和ER，ER的親和力成為雌二醇抑制劑。這兩個受體在很多海藻組織中都能找到，在基因轉(zhuǎn)錄中可以作為配體激活受體的轉(zhuǎn)錄因。盡管抑制ER，ER的與雌性激素結(jié)合活性具有相似性，ER，ER和其他配體的特異性結(jié)合可以通過他們在靶組織中不同的功能特性區(qū)別。在最近的研究報道中，沒有證據(jù)表明SD大鼠的海帶膳食治療對孕激素有影響，只有在加入海帶提取物的hlGC培養(yǎng)中孕酮有微量的增加。但是，前人有驗證墨角藻可以改善女性黃體期缺乏孕酮表現(xiàn)出較高的雌二醇水平。這種差異原因可能是之前研究報道中反常的雌激素跟孕激素比值。這就證明雌二醇高度相關的勝利濃度是一個直接的阻礙3-類固醇脫氫酶的原因，結(jié)果導致人的黃體細胞孕激素收到抑制。那些高度循環(huán)的雌二醇，墨角藻的抗雌激素不僅消除產(chǎn)生雌二醇，同時也會通過緩解雌二醇對3-類固醇脫氫酶阻礙作用來增加孕激素構(gòu)成。然而，海帶膳食治療對循環(huán)的孕激素水平潛在的影響需要更大人群作為實驗對象