冰凍組織切片樣品制備方法

1、冰凍組織切片樣品制備方法組織采集后，經(jīng)固定、冷凍、切片、晾片，方可進(jìn)行免疫抗體標(biāo)記。1、組織的采集、固定和保存：不同來源的組織可依據(jù)實驗條件和實驗?zāi)康亩紤]采用不同的固定和保存方法。此處介紹幾種實驗室常用方法。液氮冷凍法：采取新鮮組織后，即可放入液氮中，并保存于液氮中。固定法：采取新鮮組織后，4%多聚甲醛（4%PFA）4 C固定1小時（根據(jù)組織大小和致密程度調(diào)整固定時間）或過夜，PBS緩沖液洗三次，每次10-30min ,20%蔗糖中浸泡1小時或過夜， 4 C保存于20%蔗糖（含0.05%NaN3）中。2、組織的冷凍和切片：組織的冷凍方法可根據(jù)固定和保存條件不同而不同。使用冷凍切片機(jī)，將組織冰

2、切成4-20 ym的切片，粘貼于處理過的載玻片上，室溫干燥1小時后，可進(jìn)行免疫標(biāo)記?；蚍湃胼d片盒，-80 C密閉保存。氣體CO2冷凍法：將樣品置于樣品臺的 OCT中，打開鋼瓶開關(guān)，CO2氣體噴出，迅速冷凍組織樣品。干冰冷凍法：（適合小塊和致密度低的組織，如胚胎、小塊組織、活檢組織等）將小組織塊放入冷凍包埋模具中，調(diào)整切面位置（必要時可在體視鏡下操作）后，置于干冰上（暫時無干冰，可置于 -801）,待冷凍完全后，-80 C密閉保存。直接冷凍法:將樣品直接粘著在涂有 OCT的樣品臺上，于冰切機(jī)（箱體溫度-80 C）中直接冷凍。3、冰凍組織切片的免疫熒光標(biāo)記：將冰凍組織切片從-80 C冰箱中取出，室

3、溫放置10min,待切片回溫并干燥，PBS 10min洗去OCT，可無需Trit on處理，即可進(jìn)行免疫抗體標(biāo)記，操作步驟與培養(yǎng)細(xì)胞反應(yīng)方法相同。4、冰凍組織切片的免疫酶反應(yīng)：（酶聯(lián)免疫反應(yīng)，在抗體作用之前或顯色時組織樣品需進(jìn)行內(nèi)源性酶抑制作用，以降低反應(yīng)背景）堿性磷酸酶（AP）:密封保存的組織切片PBS 5mi nJ含 0.5%NS,1%BSA 的 PBS 中室溫封閉 30min-1hr-一抗（稀釋過）室溫1-1.5hr或4 C過夜PBS 10mi n 3J二抗-AP （稀釋過）室溫1.5-2hrPBS 10mi n 3J顯色：AP-CDS 5min 2NBT4.5 7/ml、BCIP3.5 7/ml in AP-CDS室溫或 37 C 5-30minTE 室溫 10min梯度乙醇脫水二甲苯透明中性樹膠封片辣根過氧化物酶（HRP):密封保存的組織切片PBS 5min3%H2O2.10% MeOH in PBS 室溫 3minPBS 5mi n 3含 0.5%NS,1%BSA 的 PBS 中室溫封閉 30min-1hr一抗（稀釋過）室溫1-1.5hr或4 C過夜PBS 10mi n 3J二抗-HRP （稀釋過）室溫1