實(shí)驗(yàn)二大腸菌群的檢驗(yàn).ppt

1、大腸菌群的定義,大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。 大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類(lèi)命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。,大腸桿菌的定義,大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類(lèi)于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。 大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為+-或-+-的細(xì)菌。 與人類(lèi)

2、有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。,大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系,耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37 培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）,衛(wèi)生學(xué)意義,大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。 食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健

3、康危害性的大小。 大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。,大腸桿菌的生物學(xué)特性,基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。,大腸桿菌的生物學(xué)特性,培養(yǎng)特性： 大腸

4、桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37，在42-44 條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46 。,在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。,大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定 MPN法檢驗(yàn)流程（FDA BAM）,檢樣50g+450ml稀釋液 適當(dāng)十倍稀釋樣品 選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液， 每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9ml LST肉湯并加有導(dǎo)管）， 每管接種1mL 35 ，

5、24 2h 48 2h 沒(méi)有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報(bào)告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培養(yǎng)） 24 2h 48 2h 查MPN表報(bào)告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜 面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）,大腸菌群測(cè)定MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明,MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋?zhuān)尤肱囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣

6、品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。 初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)： 1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。 2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證

7、實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。 產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。,大腸桿菌測(cè)定EMB選擇性分離鑒別,EMB平板典型大腸桿 菌菌落特征： 中心黑色或紫紅色，有

8、 或無(wú)綠色金屬光澤,大腸桿菌測(cè)定EMB選擇性分離鑒別,EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻； 大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤； 該培養(yǎng)基受可見(jiàn)光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。,大腸桿菌測(cè)定革蘭氏染色,基本原理： 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌兩大類(lèi)。 革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類(lèi)細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性

9、菌的細(xì)胞壁中含有較多的類(lèi)脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類(lèi)脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類(lèi)脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。,大腸桿菌測(cè)定革蘭氏染色,基本步驟： 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗； 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗； 滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗； 滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。 結(jié)果：革

10、蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。,大腸桿菌測(cè)定生化鑒定,實(shí)驗(yàn)二大腸菌群的檢驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測(cè)程序、方法； 2、掌握食品中大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式。 二、實(shí)驗(yàn)材料 1、設(shè)備和材料 溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針 2、培養(yǎng)基及試劑 乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液,GB4789.3-2010 大腸菌群計(jì)數(shù),GB4789.3-2010 大腸菌群計(jì)數(shù),（一）最先準(zhǔn)備的器材,規(guī)格名稱 數(shù)量 用途 1、500ml三角瓶 1個(gè) 稀釋樣品 2、250ml三

11、角瓶 1個(gè) 制EMB瓊脂 3、18180mm試管 9支 單料乳糖膽鹽發(fā)酵管 4、18180mm試管 3支 稀釋樣品（9ml） 5、1ml移液管 5 支 6、10ml移液管 3 支 7、直徑為90mm平皿 2套制EMB平板 8、250ml量筒 1支 9、玻璃珠：直徑約5mm,（二）應(yīng)滅菌消毒的器材 剪刀1把不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭5只稱量紙適量,（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基 總量 所用容器 蒸餾水 225ml 500ml三角瓶 蒸餾水 9ml/ 3支 27ml 18180mm試管（稀釋樣品） 乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料）： 10ml/ 9支 100ml18180mm試管(裝杜氏小管 ) EMB瓊脂：

12、1瓶 150ml 250ml三角瓶（每 組配一瓶）,蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸餾水1000ml（將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示劑）；或購(gòu)買(mǎi)制好的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、按說(shuō)明配置。分裝試管，每管10ml，并放入一個(gè)到氣管（杜氏小管），高壓滅菌115、15分鐘。 雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基除蒸餾水外，其它成分加倍。,乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：P99,A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH

13、2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2 制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。,A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌綠水溶液 13.3 mL 蒸餾水 800 mL pH 7.20.1 A.2.2 制法 將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中，

14、調(diào)節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1 000 mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。,A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） A.3.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化鈉 5.0 g 膽鹽或3號(hào)膽鹽 1.5 g 中性紅 0.03 g 結(jié)晶紫 0.002 g 瓊脂 15 g18 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.40.1,A.3.2 制法 將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH。煮沸2 min，

15、將培養(yǎng)基冷卻至45 50 傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過(guò)3 h。,蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氫二鉀 2.0g 瓊脂 15.0g伊紅 0.4g美藍(lán)0.065g 或20ml 伊紅 (20g /L)和 10ml 美藍(lán)(6.5 g /L) 蒸餾水 1000.0mL最終pH7.10.2 (25) 先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解，后加瓊脂加熱溶解，再調(diào)pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍(lán)水溶液, 高壓滅菌115、15分鐘。 蛋白胨提供細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發(fā)酵所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅Y和美藍(lán)抑制絕大部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。瓊

16、脂是凝固劑。 大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金屬光澤。沙門(mén)氏菌形成無(wú)色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長(zhǎng)。,EMB（伊紅美藍(lán)瓊脂）,質(zhì)控： 此培養(yǎng)基呈紫色，可有細(xì)微沉淀。質(zhì)控菌株接種后，35培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示：,說(shuō)明： （1）伊紅又稱署紅或四溴熒光素，為酸性染料。美藍(lán)又稱亞甲藍(lán)，為堿性染料。當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)，細(xì)菌帶正電荷，染上紅色，再與美藍(lán)結(jié)合而形成紫黑色菌落，并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外，還有抑制格蘭氏陽(yáng)性菌的作用。 （2）在堿性環(huán)境中，不分解乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌不著色。伊紅、美藍(lán)不能結(jié)合，故沙門(mén)氏菌和志賀氏菌等為無(wú)色或琥珀色半透明菌落。 （

17、3）此培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌，并可快速鑒定白色念珠菌及鑒定凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌。美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)和美國(guó)細(xì)菌協(xié)會(huì)推薦，用于增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門(mén)氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養(yǎng)基保存應(yīng)注意避光防止氧化。,樣品,1.酸奶1 2.鮮奶 3.水樣1 4.水樣2 5.水樣3 6.水樣4 7.水樣5 8.酸奶2,A1組 酸奶1,A2組 水樣1,A3組 水樣2,A4組 水樣3,B1組 鮮奶,B2組 水樣4,B3組 水樣5,B4組 酸奶2,三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1、采樣及稀釋 以無(wú)菌操作將檢樣25g（或25ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠

18、）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以800r/min1000r/min的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。 用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液,2. 乳糖初發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置（361）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（242）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行,根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。 10， 100, 1000 倍稀釋?zhuān)?1，-2，-3）,3.分離培養(yǎng)（10倍稀釋?zhuān)?將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美