紫外光譜測氨基酸類物質(zhì)實驗報告

氨基酸類物質(zhì)的紫外光譜分析和定量測定實驗報告一、實驗目的（1）掌握紫外–可見分光光度計的工作原理與基本操作。（2）學習紫外–可見吸收光譜的繪制及定量測定方法。（3）了解氨基酸類物質(zhì)的紫外吸收光譜的特點。二、實驗原理紫外-可見分光光度法屬于吸收光譜法，分子中的電子總是處在某一種運動狀態(tài)中，每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定的能級。電子由于受到光、熱、電等的激發(fā)，從一個能級轉(zhuǎn)移到另一個能級，稱為躍遷。當這些電子吸收了外來輻射的能量，就從一個能量較低的能級躍遷到另一個能量較高的能級。物質(zhì)對不同波長的光線具有不同的吸收能力，如果改變通過某一吸收物質(zhì)的入射光的波長，并紀錄該物質(zhì)在每一波長處的吸光度（A）,然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，這樣得到的譜圖為該物質(zhì)的吸收光譜或吸收曲線。當一定波長的光通過某物質(zhì)的溶液時，入射光強度I0與透過光強度It之比的對數(shù)與該物質(zhì)的濃度c及厚度b成正比。其數(shù)學表達式為：（一）式（一）為Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基礎，其中T為透光率(透射比）。物質(zhì)的吸收光譜反映了它在不同的光譜區(qū)域內(nèi)吸收能力的分布情況，不同的物質(zhì)，由于分子結構不同，吸收光譜也不同，可以從波形、波峰的強度、位置及其數(shù)目反映出來，因此，吸收光譜帶有分子結構與組成的信息。氨基酸類物質(zhì)的一個重要光學性質(zhì)是對光有吸收作用。20種氨基酸在可見光區(qū)域均無光吸收，在遠紫外區(qū)（<220nm）均有光吸收，在紫外區(qū)（近紫外區(qū)）（220nm—300nm）只有三種AA有光吸收能力，這三種氨基酸分別是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因為它們的結構均含有含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。苯丙氨酸最大吸收波長在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白質(zhì)一般都含有這三種氨基酸殘基，所以其最大光吸收在大約280nm波長處，因此能利用分光光度法很方便的測定蛋白質(zhì)的含量。本實驗將對苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三種氨基酸進行光譜測定及相關定量測定。三、儀器和試劑1儀器紫外-可見-近紅外分光光度計（UV-3600或UV-2401）；分析天平；0.5mL、1.0mL、2.0mL移液管若干；10mL帶塞比色管若干。2試劑標準溶液(a):2.0g/L的苯丙氨酸溶液；標準溶液(b)：0.4g/L的酪氨酸溶液；標準溶液(c)：0.4g/L的酪氨酸溶液（所有溶液均用去離子水配制）；酪氨酸待測樣。四、實驗步驟（1）分別移取標準溶液(a)（2.0g/L，1.0mL）、標準溶液(b)（0.4g/L，1mL）和標準溶液(c)（0.4g/L，0.4mL）標準溶液于10mL比色管中，用去離子水稀釋、定容、搖勻，待用。（2）分別移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0mL標準溶液（b）于5個10mL比色管中，并用去離子水稀釋、定容，搖勻，待用。（3）雙擊分光光度計圖標“UVProbe”,出現(xiàn)軟件界面，點左下角“連接”，系統(tǒng)開始自檢，等系統(tǒng)自檢結束。預熱15-30分鐘。待儀器穩(wěn)定后方可使用。（4）在光譜測量模式下，以去離子水為參比溶液，分別繪制步驟（1）中各溶液在200～350nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。并記錄各標準溶液的λmax。（5）在定量測定模式下，以去離子水為參比溶液，測定步驟（2）中的各標準溶液在λmax處的吸光度。（6）在步驟5同樣條件下，測定未知樣品溶液在λmax處的吸光度。數(shù)據(jù)處理與分析1、將苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光譜疊加在一個坐標系中如下:由圖中可以看出，苯丙氨酸的最大吸收波長為257.73nm；色氨酸為278.70nm；酪氨酸為275.15nm。對酪氨酸和色氨酸的光譜圖作1-4階導數(shù)分別如下：一階導數(shù)二階導數(shù)三階導數(shù)四階導數(shù)通過觀察可知四階導數(shù)光譜在230.49nm處色氨酸與酪氨酸分離最完全,故選取四階導數(shù)處理標準液和未知樣品。3.將標準液的光譜圖分別做四階導數(shù)曲線如下：4.將未知樣的光譜圖做四階導數(shù)曲線如下：由圖知未知樣在230.49nm處的吸光度為-0.048.將以上述步驟測得的各標準酪氨酸溶液的吸光度為縱坐標，相應的濃度為橫坐標繪制工作曲線如下：所得直線擬合方程為：Y=5×10-4-0.0026X.6.將未知樣的吸光度（-0.048）代入得到的標準工作曲線方程，解得未知樣中色氨酸的濃度為:18.654mg/L.六、思考題（1）本實驗是采用紫外吸收光譜中最大吸收波長進行測定的，是否可以在波長較短的吸收峰下進行定量測定，為什么？答：最大吸收處信號強度較大，誤差較小，如果在較小的吸收峰下進行測定，峰值易受其它因素影響，而且讀數(shù)誤差較大，不是很合適。（2）被測物濃度過大或過小對測量有何影響？應如何調(diào)整？調(diào)整的依據(jù)是什么？答：濃度過大導致信號過大，在實際的測量中可能超出實驗范圍；而濃度過小可能會導致吸收峰不明顯，給實驗和計算帶來較大誤差。在實際實驗中，應挑選在線性范圍內(nèi)的濃度相對平均合適的幾個點進行測量，保證實驗的準確性。（3）思考紫外-可見分光光度法應用于蛋白質(zhì)測量的依據(jù)，并設計相應的實驗方案，測定奶粉中蛋白質(zhì)的含量。答：蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的芳香環(huán)結構對紫外光有吸收作用。色氨酸的吸收最強，但由于一般蛋白質(zhì)中酪氨酸的含量比色氨酸高許多，因此這一吸收可認為主要是由酪氨酸提供的。其最大值在280nm附近，不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別。在無其他干擾物質(zhì)