腎絡(luò)寧對(duì)iga腎病大鼠腎小管間質(zhì)損害的干預(yù)作用

腎絡(luò)寧對(duì)iga腎病大鼠腎小管間質(zhì)損害的干預(yù)作用

采用中藥復(fù)方腎絡(luò)寧治療iga腎病取得良好的臨床效果，采用牛血清蛋白b和乳突腸毒素b的復(fù)合感染法制作了iga腎病模型。通過(guò)常規(guī)的生物化學(xué)和病理分析，采用原代異交、免疫組化和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。i-1（圖gf-1）基比妥-1（pmp-1）基比妥-1（圖根比妥-1）磷酸酶-1（pmp-1）和i-1（imp-1）對(duì)氨基金屬酶-1（5mmp-1）和氨基金屬酶-1（imp-1）的影響，如下報(bào)告。材料和方法1藥物、藥品與藥物牛血清白蛋白(BSA)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所提供,葡萄球菌腸毒素B(SEB)由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑由天象人生物有限公司提供。腎絡(luò)寧由柴胡、黃芪、女貞子、白花蛇舌草、山楂等組成,藥物購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房,按比例稱取后加水濃煎至3g/ml;腎炎康復(fù)片由天津同仁堂制藥廠提供。2各組及治療方法選用健康SD大鼠40只,雌雄各半,體重(100±20)g,由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院四所提供。經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,查尿紅細(xì)胞、蛋白陰性。隨機(jī)分為正常組、模型組、腎絡(luò)寧組、腎炎康復(fù)片組,每組10只。模型組與腎絡(luò)寧組及腎炎康復(fù)片組自實(shí)驗(yàn)第1d隔日灌服BSA100mg/kg,0.1%稀鹽酸配制。第6周尾靜脈注射BSA10mg/kg,以生理鹽水稀釋。每日1次連續(xù)3d。第8周尾靜脈注射SEB0.4mg/kg,生理鹽水稀釋,每周1次連續(xù)3d,同時(shí)腹腔注射弗氏佐劑0.2ml。腎絡(luò)寧組及腎炎康復(fù)片組,自實(shí)驗(yàn)的第1d起灌服以成人劑量/kg體重15倍劑量的濃縮藥液,正常組以等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行16周。3計(jì)數(shù)紅細(xì)胞指標(biāo)(1)尿紅細(xì)胞艾迪氏計(jì)數(shù):用代謝籠收集12h尿液,用量筒稱量后取其中一部分離心,1800r/min,離心15min,棄上清液將尿沉渣滴于計(jì)數(shù)盤內(nèi),低倍鏡下計(jì)數(shù)紅細(xì)胞。(2)24h尿蛋白測(cè)定:比色法,使用半自動(dòng)生化分析儀(VITALABMICRO,荷蘭)檢測(cè),試劑盒由天象人生物工程有限公司提供,批號(hào):0102150。(3)血肌酐、尿素氮測(cè)定:苦味酸法,使用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)(荷蘭),試劑盒由天象人公司提供。(4)尿N-2酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性測(cè)定:比色法,采用721分光光度計(jì)檢測(cè),試劑盒由上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司、上海亞都生物技術(shù)研究所提供。批號(hào):TY0109。4免疫熒光檢測(cè)臟器超微結(jié)構(gòu)的制備(1)光鏡:腎臟標(biāo)本用10%福爾馬林固定,石蠟包埋切片(3μm),分別作HE、PAS、Massion染色,觀察組織形態(tài)學(xué)變化。(2)電鏡:新鮮標(biāo)本用6%冷戌二醛固定,1%鋨酸后固定,乙醇逐級(jí)脫水Epon812樹脂包埋,定位后制成600×10-10m厚的超薄切片,醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染色,PlipisEN400-ST電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化及有無(wú)電子致密物。(3)免疫熒光:檢測(cè)抗體IgA,用組織包埋后,液氮速凍,由Leica2800型冰凍切片機(jī)(法國(guó)產(chǎn))制成4μm厚的冰凍切片,貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,室溫下晾干,0.1MPBS緩沖液洗滌3min,洗2次,滴加異硫氰酸熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgA抗體(上海康成生物工程公司提供)。室溫放置1h,PBS洗滌5min,洗3次,晾干后甘油封片,在Nikon熒光顯微鏡下觀察IgA沉積情況,以亮綠色為陽(yáng)性染色。5免疫組化檢測(cè)5.1試劑與試劑以及試劑TGF-β1原位雜交及免疫組化試劑盒,Ⅲ型膠原免疫組化試劑盒、PAI-1原位雜交試劑盒、MMP-1原位雜交試劑盒、TIMP-1原位雜交試劑盒,以上試劑均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。5.2制備物、試劑和儀器新鮮腎組織以O(shè)CT包埋后液氮速凍,由Leica2800型冰凍切片機(jī)(法國(guó))制減3μm厚的冰凍切片,加入1/1000DEPC的冷丙酮室溫固定30min,然后用蒸餾水洗滌3次;新鮮配制0.5%H2O2/甲醇室溫30min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,蒸餾水洗滌5min×3次;滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的復(fù)合消化液,37℃消化120s,以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶0.5MPBC水洗5min×3次;雜交:雜交盒底部加250ml蒸餾水,每張切片滴加20μl含寡核苷酸探針的原位雜交液,恒溫箱37℃雜交過(guò)夜;洗滌:2×SSC洗滌5min×3次;穩(wěn)定雜交探針:每張切片取2μl雜交探針?lè)€(wěn)定液A和18μl雜交探針?lè)€(wěn)定液B混勻(臨時(shí)配制),滴在切片上,濕盒中37℃后應(yīng)5min。2×SSC洗滌5min×3次;滴加封閉液;37℃20min,甩去多余液體;滴加免抗地高辛:37℃10min,0.5MPBS洗滌2min×3次;滴加生物素化辛抗兔IgG:37℃30min,0.5MPBS洗滌5min×4次;DAB顯色,使用DAB顯色試劑盒1ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴混勻滴加至標(biāo)本上,顯色30min后充分水洗;蘇木素輕度復(fù)染,酒精梯度脫水,二甲苯透明,樹脂封片。本實(shí)驗(yàn)以不加探針作為陰性對(duì)照。鏡下觀察拍照,陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色。5.3單克隆抗體sabc腎組織常規(guī)10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋,切片厚度3～4μm,采用SABC法,切片脫蠟至水;蒸餾水新鮮配制0.3%H2O2,室溫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,TBS洗5min×3次;抗原熱修復(fù),將切片浸入0.1MpH6.0的枸椽酸鹽緩沖液中,92℃加溫保濕20min;滴加TBS稀釋的羊抗大鼠α-SMA、FN、ICAM-1單克隆β抗體,過(guò)夜。TBS洗5min×3次;滴加稀釋的小鼠抗羊二抗,室溫30min,TBS洗5min×3次;滴加稀釋的SABC復(fù)合物,室溫30min,TBS洗5min×3次;滴加DAB-H2O2顯色液顯色,蘇木素輕度復(fù)染,封片。鏡下觀察拍照,陽(yáng)性物呈棕黃色。6半定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色圖像分析系統(tǒng),對(duì)各組動(dòng)物腎小管間質(zhì)組織切片進(jìn)行半定量分析。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性視野,于200～400倍高倍鏡下,測(cè)量每個(gè)視野中腎小管間質(zhì)陽(yáng)性區(qū)域面積與所測(cè)量區(qū)域的總面積百分比,計(jì)算出平均值,以該值作為TGF-β1、Col-Ⅲ、PAI-1、MMP-1及TIMP-1在腎小管間質(zhì)中的相對(duì)含量。7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSSforWindows10.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析。結(jié)果1血胱之水作用從表1結(jié)果提示,腎絡(luò)寧及腎炎康復(fù)片均有減輕IgA腎病大鼠血尿、蛋白尿、降低血肌酐、尿素氮及NAG活性的作用。在減輕蛋白尿、血肌酐、尿素氮方面腎絡(luò)寧組略優(yōu)于腎炎康復(fù)片組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在減少尿紅細(xì)胞、降低NAG治性方面腎絡(luò)寧組優(yōu)于腎炎康復(fù)片組(P<0.01或P<0.05)。2病理結(jié)果2.1腎絡(luò)寧及腎康復(fù)片對(duì)腎、腎功能的影響結(jié)果顯示,模型組腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性,空泡變性,細(xì)胞腫脹,管腔狹窄,甚至閉塞;間質(zhì)纖維組織增生;腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生。腎絡(luò)寧及腎炎康復(fù)片組腎小管及腎小球的病變明顯輕于模型組。見圖1、圖2。模型組腎小管管腔面積與腎小管面積的比值明顯小于正常組(P<0.01);腎絡(luò)寧組與腎炎康復(fù)片組腎小管腔面積與腎小管面積比值明顯大于模型組(P<0.01),而腎絡(luò)寧組又大于腎炎康復(fù)片組。提示腎絡(luò)寧可減輕IgA腎病大鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹及管腔縮小,且優(yōu)于腎炎康復(fù)片組。見表2。2.2腎絡(luò)寧和腎康復(fù)片對(duì)肝腎上皮細(xì)胞的影響正常組腎小管上皮細(xì)胞無(wú)明顯異常,基底膜厚度正常,線粒體清晰,結(jié)構(gòu)正常。模型組腎小管上皮細(xì)胞中散在蛋白滴,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張形成一大空腔、線粒體消失、數(shù)量減少、間質(zhì)可見纖維細(xì)胞增生和膠原纖維形成。腎絡(luò)寧和腎炎康復(fù)片組腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,一部分線粒體模糊。模型組腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生,并可見電子致密物沉積。腎絡(luò)寧組與腎炎康復(fù)片組系膜細(xì)胞無(wú)明顯增生或輕度增生,無(wú)明顯電子致密物。見圖3～圖5。2.3模型復(fù)制和復(fù)制正常組腎小球系膜區(qū)無(wú)IgA、IgG沉積;模型組表現(xiàn)為系膜區(qū)彌漫性顆粒狀I(lǐng)gA沉積,個(gè)別呈團(tuán)塊狀(見圖6),表明模型復(fù)制成功。腎絡(luò)寧組與腎炎康復(fù)片組IgA沉積較模型組顯著減輕,而腎絡(luò)寧組又較腎炎康復(fù)片輕;IgG沉積相對(duì)較少,主要在毛細(xì)血管袢處,模型組最重,腎絡(luò)寧組、腎炎康復(fù)片組減輕。3mmp-1表達(dá)情況從表3結(jié)果顯示,腎絡(luò)寧與腎炎康復(fù)片均有降低TGF-β1、Col-Ⅲ、PA1-1、MMP-1、TIMP表達(dá),升高M(jìn)MP-1表達(dá)的作用,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01);而腎絡(luò)寧在以上項(xiàng)各表達(dá)中均優(yōu)于腎炎康復(fù)片,兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。表明腎絡(luò)寧能顯著降低細(xì)胞外基質(zhì),降低基質(zhì)促進(jìn)因子、基質(zhì)降解抑制因子,升高基質(zhì)降解因子的活性,從而減輕IgA大鼠腎小管間質(zhì)的損害。間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖及相關(guān)問(wèn)題IgA腎病是原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型之一,約有50%的患者在患病20年后進(jìn)行性發(fā)展至終末期腎衰竭。近年來(lái)的深入研究使人們認(rèn)識(shí)到IgA腎病的進(jìn)行性惡化不僅與腎小球損害有關(guān),更與腎小管間質(zhì)損害密切相關(guān)。腎小管間質(zhì)損害是大部分炎癥和非炎癥性腎小球疾病發(fā)展的共同最終通路。國(guó)內(nèi)609例IgA腎病患者的臨床和病理分析發(fā)現(xiàn),腎小管間質(zhì)病變可能是決定IgA腎病預(yù)后的關(guān)鍵因素之一,但是與腎小球及血管病變程度亦呈平行關(guān)系。IgA腎病中的腎小管間質(zhì)損傷是腎小球固有細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、浸潤(rùn)炎細(xì)胞、趨化因子、生長(zhǎng)因子、炎癥介質(zhì)多個(gè)環(huán)節(jié)相互作用的綜合結(jié)果。其中NAG酶、細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥硬化因子在IgA腎病腎小管間質(zhì)損害中具有非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)參照Emancipator和劉志紅的造模方法,以BSA和SEB復(fù)合感染的途徑制作大鼠IgA腎病模型,造模16周,觀察到腎小管間質(zhì)損害的病理改變:腎小球系膜細(xì)胞增生,基質(zhì)增多;腎小管上皮細(xì)胞變性,有蛋白滴沉積,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張形成一大空腔,線粒體結(jié)構(gòu)消失,數(shù)量減少;間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及膠原纖維形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示模型組腎組織NAG明顯升高,腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β1強(qiáng)表達(dá),小管上皮細(xì)胞基底膜及腎間質(zhì)Ⅲ型膠原表達(dá)顯著增強(qiáng),TGF-β1與間質(zhì)Col-Ⅲ間存在顯著相關(guān)性,表明TGF-β1的合成增加促進(jìn)了腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌膠原的能力。在腎間質(zhì)血管平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞漿中PAI-1表達(dá)明顯增多。小管及間質(zhì)MMP-1表達(dá)顯著降低,而TIMP-1則呈高表達(dá),這些相關(guān)因子的表達(dá)變化與大鼠IgA腎病腎小管間質(zhì)損害的病理變化是相一致的。根據(jù)IgA腎病水腫、蛋白尿、血尿等臨床表現(xiàn),屬中醫(yī)水腫、血尿、虛勞等范疇,其發(fā)病機(jī)制主要為脾腎虧損、氣陰兩虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻絡(luò),而少陽(yáng)三焦氣化不利是其中的關(guān)鍵,因此治療大法以疏利少陽(yáng)為主,兼益氣養(yǎng)陰、清利濕熱、活血化瘀,標(biāo)本兼治多法并用、綜合調(diào)理。腎絡(luò)寧是根據(jù)中醫(yī)對(duì)IgA腎病的理論認(rèn)識(shí)和臨床經(jīng)驗(yàn),結(jié)合現(xiàn)代藥理研究結(jié)果而組成的中藥復(fù)方。該方由柴胡、黃芪、女貞子、白花蛇舌草、山楂等組成。其中柴胡疏利少陽(yáng)、清解郁熱、暢達(dá)三焦、樞轉(zhuǎn)氣機(jī);黃芪補(bǔ)肺脾之氣,女貞子益肝腎之陰,二者相伍補(bǔ)氣不過(guò)于溫燥、滋陰不至于呆膩;白花蛇舌草,清熱解毒利濕;山楂入血分活血化瘀。諸藥相伍既有整體調(diào)節(jié),又有對(duì)因治療,從不同側(cè)面增強(qiáng)或恢復(fù)臟腑的氣化功能,從而達(dá)到控制疾病的目的。現(xiàn)代藥理研究表明,柴胡中的有效成分柴胡皂苷具有皮質(zhì)酮激素樣作用,K+、Na+-ATP酶抑制作用,以及抑制血小板活性因子,抑制腎小球內(nèi)IgA陽(yáng)性細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn),從而產(chǎn)生抗炎、抗凝、調(diào)節(jié)代謝、調(diào)節(jié)免疫等作用。黃芪具有利尿、抗氧化、降低血糖,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,增加血漿蛋白、抑制高膽固醇血癥。女貞子多糖可清除自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,調(diào)節(jié)免疫功能。白花蛇舌草能夠啟動(dòng)T細(xì)胞,提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率,并能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞顯著增生,增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能,有效地抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生,并有增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能作用,此與抑制炎癥反應(yīng)和特異反應(yīng)有關(guān)。山楂具有明顯的抗氧化及降低血脂,改善血液流變學(xué)的作用,有助于免疫復(fù)合物的清除和腎組織病變的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腎絡(luò)寧防治IgA腎病大鼠16周,觀察到腎絡(luò)寧可以減輕IgA腎病大鼠血尿、蛋白尿、降低血尿素氮和肌酐水平;降低NAG酶含量,明顯減輕IgA腎病大鼠腎小管間質(zhì)病