柴胡疏肝湯對難治性癲癇模型大鼠腦電圖及p-gp表達(dá)的影響

柴胡疏肝湯對難治性癲癇模型大鼠腦電圖及p-gp表達(dá)的影響

癲癇是一種由多種原因引起的臨床綜合征，以短期中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征。大多數(shù)癲癇患者經(jīng)過一段時間的正規(guī)藥物治療后,病情可以得到控制,但仍有少數(shù)患者,藥物治療并不能夠減輕發(fā)作的頻率和強(qiáng)度,稱為難治性癲癇(refractoryepilepsy,RE)。RE預(yù)后差,常伴有智能障礙和神經(jīng)缺損,因此了解RE的發(fā)生機(jī)制并尋找有效的治療方法十分必要。中醫(yī)藥治療癲癇歷來“從痰論治”,本課題組提倡癲癇“從肝論治”,自擬“柴胡疏肝湯”,治療RE取得了較好療效。本研究建立了氯化鋰-匹羅卡品RE模型,擬進(jìn)一步探討柴胡疏肝湯抗RE的機(jī)制以及腦電圖的變化。1材料表面1.1動物雄性SPF級SD大鼠,體重180~220g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物合格證號SCXK(粵)2006-0015。1.2藥物、試劑和動物氯化鋰(lithiumchloride)(Sigma公司,批號115K1308);鹽酸匹羅卡品(pilocarpine,Sigma公司,批號066k1730);丙戊酸鈉(VPA,廣譜抗癲癇藥)片劑(杭州賽諾菲圣德拉保民生制藥有限公司,批號0402049);小鼠抗大鼠P-糖蛋白單克隆抗體(C219)(abcam公司,貨號ab3364);羊抗小鼠IgG-HRP(武漢博士德生物工程有限公司);監(jiān)視器以及視頻采集系統(tǒng)(廣州鷹保智能設(shè)備有限公司);EEG-4418K型腦電圖儀(NIHONKOHDEN公司);柯達(dá)2000MM全光譜多功能活體成像系統(tǒng)(美國Kodak公司)。2模型的構(gòu)建和給藥2.1造模方法參照王本國等人的方法,小劑量反復(fù)ip匹羅卡品制備顳葉癲癇大鼠模型。100只SD大鼠,除10只空白對照(A)外,其余90首日ip氯化鋰(125mg·kg-1),18~24h后ip阿托品1mg·kg-1,30min后ip匹羅卡品(10mg·kg-1)。如未出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE),則每隔30min繼續(xù)ip匹羅卡品(10mg·kg-1),直至大鼠出現(xiàn)SE后停止注射。待SE出現(xiàn)60min,ip10%的水合氯醛(350mg·kg-1)終止發(fā)作。癇性發(fā)作行為觀察,參照Racine標(biāo)準(zhǔn),0級:無發(fā)作反應(yīng);Ⅰ級:節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動陣攣;Ⅱ級:點(diǎn)頭并伴隨更嚴(yán)重的面部肌肉抽動陣攣;Ⅲ級:出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立;Ⅳ級:前肢陣攣伴隨直立;Ⅴ級:全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作而跌倒。Ⅳ級以上發(fā)作為成功的癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。未達(dá)到Ⅳ~Ⅴ級發(fā)作的棄用。2.2篩選實(shí)驗(yàn)動物癲癇狀態(tài)后的大鼠在經(jīng)過24h的急性期后,進(jìn)入10~15d左右的潛伏期,每天給予5%糖鹽水5mL,ip,2次/d。15d后進(jìn)入4周慢性期,進(jìn)行Vedio監(jiān)測。按照以上標(biāo)準(zhǔn),Ⅳ級以上發(fā)作為成功的癲癇自發(fā)發(fā)作模型。將成功的癲癇自發(fā)發(fā)作模型大鼠隨機(jī)分為5組,模型組(B)、VPA組(C)、柴胡疏肝湯低(D)、中(E)、高(F)劑量組。2.3給藥2.3.1藥物配制柴胡疏肝湯藥物組成及制備:本方由柴胡、黨參、半夏、桂枝、黃芩、白芍、當(dāng)歸、川芎、生地、甘草、生姜、大棗、生龍骨、生牡蠣、鉤藤組成,煎煮至質(zhì)量濃度按生藥量計1g·mL-1。VPA用生理鹽水配制成20g·L-1的溶液,應(yīng)用超聲恒溫水浴振蕩器震蕩12h助溶。2.3.2給藥方法空白組和模型組常規(guī)飼養(yǎng)給予等量生理鹽水ig,VPA組用量為0.2g·kg-1,柴胡疏肝湯低、中、高劑量依次為4.5,9,18g·kg-1。各組大鼠均連續(xù)ig治療8周。2.4記錄難治性癲癇動物模型的制備和存活情況2.5腦電圖描記8周治療結(jié)束時,以上每組隨機(jī)各取3只大鼠進(jìn)行腦電圖描記。電極埋置方法參照文獻(xiàn)方法。采用EEG-4418K型腦電圖儀描記各組大鼠腦電圖,紙速30mm·s-1,時間常數(shù)0.1s,濾波35Hz,增益10μV·mm-1,定標(biāo)為50μV/5mm,連續(xù)描記5min。2.6Westernblotting檢測治療結(jié)束時,每組隨機(jī)取3只大鼠,麻醉后,斷頭取腦,冰上迅速分離海馬、顳葉皮層,放入-80℃低溫冰箱保存。蛋白裂解后,BCA法定量,制備SDS凝膠,加樣電泳,待溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部時結(jié)束電泳。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉TBST封閉液中,置于水平搖床上,室溫封閉1h,然后用TBST清洗3次,每次5min。用TBST配制一抗(小鼠抗大鼠P-gp1∶25),將PVDF膜放入配好的抗體稀釋液中,4℃過夜,TBST清洗3次,每次10min;放入用TBST配制HRP標(biāo)記的二抗(羊抗小鼠IgG1∶2000),室溫1h。二抗孵育完后,TBST洗膜3次,每次10min;吸干多余的TBST,用BeyoEClplus發(fā)光液顯影(A液與B液1∶1配置),KodakImageStation2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,用圖像處理軟件ImageTool3.0分析各蛋白條帶的灰度值,用P-gp/β-actin代表蛋白條帶的灰度比值。2.7統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用表示,采用單因素方差分析(One-WayANOVA),組間比較采用LSD法。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1模型大鼠的篩選在實(shí)驗(yàn)過程中,共對90只大鼠點(diǎn)燃制備難治性癲癇模型。其中8只大鼠反復(fù)給予匹羅卡品,始終無法誘發(fā)出SE,故棄用,其余82只大鼠在首次或追加匹羅卡品后開始出現(xiàn)癇性發(fā)作,并逐步達(dá)到SE。在急性期(24h)內(nèi),有11只大鼠因癲癇頻繁抽搐而死亡。在潛伏期內(nèi)(2周),因頻繁抽搐以及不能自主進(jìn)食衰竭死亡共13只,多在SE后1周死亡,進(jìn)入慢性期。在慢性期4周,存活的的大鼠均出現(xiàn)自發(fā)發(fā)作,發(fā)作級別從1級逐漸發(fā)展至5級,無致癇大鼠死亡,共有58只大鼠存活,進(jìn)入篩選。篩選出50只模型大鼠,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表,分為B,C,D,E,F劑量組,每組10只,另有A組10只。各組給藥期間,除B組大鼠有1只死亡外,其余大鼠均存活至治療結(jié)束。3.2散在性癲癇波和胡徑A組大鼠皮質(zhì)及海馬腦電圖以基礎(chǔ)波即α,β波為主,無明顯節(jié)律性;B組大鼠出現(xiàn)散在性癇波,多為棘波、尖波、棘慢復(fù)合波,出現(xiàn)大量癇性放電;C,D,E,F組均可見到散在的棘波、尖波出現(xiàn),而以F組出現(xiàn)的最少。表明VPA和柴胡疏肝湯各劑量組均能抑制大鼠的癇性放電,以柴胡疏肝湯高劑量組明顯。各組大鼠腦電圖見圖1。3.3對海馬區(qū)p-gp蛋白表達(dá)的影響如表1所示,在大鼠海馬區(qū),WesternBlotting檢測各組P-gp表達(dá)的灰度比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果表明,給藥后VPA明顯增強(qiáng)P-gp蛋白的表達(dá),柴胡疏肝湯中、高劑量均可以降低海馬區(qū)P-gp蛋白的表達(dá),以高劑量組明顯。在大鼠顳葉皮層,P-gp表達(dá)的灰度比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果表明,給藥后柴胡疏肝湯中、高劑量均可以降低顳葉皮層P-gp蛋白的表達(dá),以高劑量組明顯。4對re治療的促進(jìn)癲癇屬于中醫(yī)“癇病”范疇,“諸暴強(qiáng)直,皆屬于風(fēng)……諸風(fēng)掉弦,皆屬于肝”。癇病的病機(jī)與肝的疏泄功能異常關(guān)系密切,其風(fēng)、痰、瘀產(chǎn)生均為肝失疏泄、條達(dá)的病理變化,因而治肝是癇病的關(guān)鍵所在?，F(xiàn)代名醫(yī)熊輔信和陳寶田教授治療上緊緊抓住“氣、風(fēng)、痰、瘀”四個方面,尤推崇癲癇“從肝論治”。本課題治療癲癇,從肝立論,創(chuàng)立柴胡疏肝湯,該方以柴胡桂枝湯為底方,配四物湯,加生龍牡、鉤藤組成,具有疏肝養(yǎng)肝、柔肝平肝、鎮(zhèn)肝潛陽之效。近年受到腫瘤多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)機(jī)制的啟示,多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體在癲癇患者腦內(nèi)的表達(dá)受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)RE患者腦內(nèi)特別是血腦屏障部位存在多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物靶酶的高表達(dá),可能參與了RE的耐藥,目前認(rèn)識較多的是P-gp。若腦內(nèi)P-gp表達(dá)增高,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔側(cè)的P-gp可將抗癲癇藥物(AEDs)泵回血中,導(dǎo)致藥物擴(kuò)散入腦的數(shù)量減少,導(dǎo)致RE多藥耐藥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)RE患者顳葉海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元內(nèi)P-gp的表達(dá)顯著增加。P-gp過度表達(dá)與癲癇發(fā)作有關(guān),但也與使用AEDs產(chǎn)生誘導(dǎo)有關(guān)。在體外培養(yǎng)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明,常用AEDs如PB、VPA等作用一段時間后,細(xì)胞MDR1表達(dá)均有不同程度增強(qiáng),且與劑量、時間有關(guān),提示P-gp/MDR1表達(dá)增強(qiáng)可能與抗癲癇藥物的誘導(dǎo)有關(guān)。藥物誘導(dǎo)MDR1的過度表達(dá)的機(jī)制尚未明確。有學(xué)者認(rèn)為,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是最重要的調(diào)節(jié)途徑。藥物作為外源性刺激劑,通過增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性或其他機(jī)制,促進(jìn)MDR1啟動區(qū)CpG位點(diǎn)去甲基而激活MDR1的轉(zhuǎn)錄是該途徑的最后通路。我們的研究結(jié)果提示,模型組和VPA組腦內(nèi)P-gp蛋白的表達(dá)較正常組增強(qiáng),VPA組更明顯,這與既往報道相一致。而柴胡疏肝湯低、中、高劑量均可以不同程度的降低腦內(nèi)P-gp蛋白的表達(dá),減少