立體定向手術(shù)大鼠顳葉癲癇模型的建立及模型永久癲癇病理學(xué)基礎(chǔ)的觀察

立體定向手術(shù)大鼠顳葉癲癇模型的建立及模型永久癲癇病理學(xué)基礎(chǔ)的觀察

過去，海洋酸（ka）用于建立大鼠癲癇模型，主要通過系統(tǒng)給藥方法進(jìn)行。國(guó)內(nèi)外偶有局部給藥制作顳葉癲癇模型用于科研者,但均未對(duì)模型本身進(jìn)行全面和系統(tǒng)的研究。同時(shí),所用海人酸的濃度和劑量等差異較大。我們通過立體定向技術(shù),對(duì)海馬局部給藥建立大鼠顳葉癲癇模型所需海人酸的濃度和劑量以及模型癲癇敏感性永久存在的病理學(xué)基礎(chǔ)等進(jìn)行了較系統(tǒng)和全面的研究,報(bào)道如下。材料和方法一、海人酸飼養(yǎng)體重250g的健康成年雄性Wistar大鼠30只,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所提供。采取自由進(jìn)食水、自然晝夜的方法飼養(yǎng)。海人酸為美國(guó)Sigma公司提供。立體定向儀為國(guó)營(yíng)西北光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。WZ-50型微量注射機(jī)由浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。ML118型腦電圖儀為澳大利亞AD儀器公司生產(chǎn)。1720DIGITAL型LEITZ冰凍病理切片機(jī)由德國(guó)生產(chǎn)。二、方法1.海馬ca3的給藥點(diǎn)控制系統(tǒng)用10%水合氯醛1ml腹腔內(nèi)注射麻醉后,將大鼠固定于立體定向儀上。剪除大鼠頭頂部的毛發(fā)并用75%的酒精消毒處理。沿大鼠頭頂部正中線切開頭皮,用頭皮拉鉤將左右兩側(cè)的頭皮對(duì)稱地向兩側(cè)拉開并固定。確定海馬CA3的三維坐標(biāo):X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=-6.0mm,即海馬區(qū)給藥點(diǎn)。首先調(diào)整X軸和Y軸的坐標(biāo),使定位針的尖端位于三維坐標(biāo)系的H點(diǎn),H點(diǎn)的坐標(biāo)為:X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=0mm。然后將位于顱骨上的H點(diǎn)鉆透。第二步,在微量注射器內(nèi)抽入濃度為0.4μg/μl的海人酸2.5μl。然后調(diào)整Z軸的坐標(biāo),使Z軸的坐標(biāo)為-6.0mm,即向下進(jìn)針達(dá)CA3中心點(diǎn)。第三步,調(diào)整微量注射機(jī)的注射速度,使2.5μl海人酸在10min內(nèi)緩慢勻速地注射完畢,留置3min后退出注射針。然后,全層縫合頭皮。對(duì)手術(shù)后大鼠的行為學(xué)進(jìn)行觀察并攝像記錄。2.致癲側(cè)海馬結(jié)構(gòu)的測(cè)定于癲癇發(fā)作后6h隨機(jī)抓取2只癲癇鼠,首先用10%水合氯醛麻醉,然后將其固定在立體定向儀上,注射海人酸側(cè)半側(cè)開顱,利用3個(gè)導(dǎo)聯(lián)記錄腦電活動(dòng)。其中1條電極刺入對(duì)側(cè)乳突部頭皮下,另1條電極刺入致癲側(cè)的海馬結(jié)構(gòu),第3條電極分別置于嗅球、紋狀體和大腦皮質(zhì),進(jìn)行腦電的監(jiān)測(cè)和記錄。腦電圖記錄完畢后,打開胸腔暴露出心臟。用1%和4%的多聚甲醛依次通過心臟進(jìn)行灌注后,斷頭完整取出腦組織,放入4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定,然后將腦組織移入30%蔗糖磷酸緩沖液中4℃過夜。在冰凍切片機(jī)上切取30μm厚的冠狀腦片,進(jìn)行Nissl染色形態(tài)學(xué)檢查。然后,在模型建立后1d、3d、5d、7d及2周、3周、4周、5周、6周、7周和8周分別隨機(jī)抓取2只癲癇鼠,進(jìn)行腦電圖監(jiān)測(cè)和病理學(xué)檢查。結(jié)果一、麻醉不同時(shí)間后大鼠的癲癇發(fā)展情況自海馬內(nèi)注入海人酸后到麻醉清醒的大約1h期間,大鼠基本上處于安靜的麻醉狀態(tài),偶爾出現(xiàn)身體的瞬間抖動(dòng)。麻醉清醒后的大約30min內(nèi),大鼠的活動(dòng)較少,有時(shí)有凝視和“濕狗樣抖動(dòng)(wet-dogshakes)”。麻醉清醒30min后,大鼠的“濕狗樣抖動(dòng)”和凝視逐漸頻繁,間或出現(xiàn)口的咀嚼運(yùn)動(dòng)。麻醉清醒近1h時(shí),大鼠逐漸變得略微活躍,口的咀嚼運(yùn)動(dòng)和面部抽搐逐漸頻繁,并且有大量唾液從口腔流出,同時(shí),大鼠的雙眼裂變大,雙眼球向外突出,逐漸出現(xiàn)幅度不斷增大的點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng),間或出現(xiàn)左側(cè)(注射對(duì)側(cè))前肢的抽搐和搔頭動(dòng)作。麻醉清醒大約1.5h后,大鼠的前肢抽搐逐漸頻繁,前肢的抽搐由單側(cè)(注射對(duì)側(cè))抽搐很快發(fā)展到雙側(cè)抽搐,抽搐時(shí),前肢向上抬起,身體亦抬起呈半立位,但以注射對(duì)側(cè)相對(duì)較重。麻醉清醒近2h時(shí),大鼠在不斷重復(fù)上述表現(xiàn)的基礎(chǔ)上,由前肢劇烈抽搐,發(fā)展到身體逐漸強(qiáng)直,呈角弓反張,逐漸出現(xiàn)頻繁的雙后肢抽搐、后退、向后跌倒和身體旋轉(zhuǎn)跌倒,在較短的發(fā)作間期,大鼠表現(xiàn)呆板、呆滯。麻醉清醒后3h時(shí),大鼠的發(fā)作頻率逐漸下降,發(fā)作形式主要為身體強(qiáng)直、雙后肢抽搐、跌倒、雙前肢抽搐、點(diǎn)頭、咀嚼、流涎、面部抽搐等。麻醉清醒后5h,發(fā)作頻率逐漸減少,主要發(fā)作形式為雙前肢抽搐、咀嚼、點(diǎn)頭、流涎等,發(fā)作間期逐漸延長(zhǎng),但發(fā)作間期的行為仍然呆板、呆滯。麻醉清醒7h時(shí),約10min出現(xiàn)1次發(fā)作,主要表現(xiàn)為雙側(cè)或單側(cè)前肢抽搐、點(diǎn)頭、咀嚼等,發(fā)作間期,大鼠變得略微活躍。麻醉清醒8h時(shí),約20～30min有1次發(fā)作,表現(xiàn)為單側(cè)前肢抽搐、點(diǎn)頭等,發(fā)作間歇期,大鼠的活動(dòng)有所增多,雙眼球向外突出逐漸減輕。至麻醉清醒后約11h,大鼠的癲癇發(fā)作逐漸停止,大鼠的活動(dòng)雖有增多,但仍未達(dá)到正常大鼠的狀態(tài)。24h后,大鼠的活動(dòng)恢復(fù)正常。24h至2個(gè)月期間,每1周大鼠出現(xiàn)1～3次發(fā)作,主要表現(xiàn)為咀嚼、點(diǎn)頭、單側(cè)或雙側(cè)前肢抽搐、身體強(qiáng)直等。二、海馬外膠質(zhì)與海馬的膠波放電模型建立后6h,腦電記錄的情況為海馬的叢集性棘波放電,嗅球、紋狀體和大腦皮質(zhì)未記錄到棘波放電。模型建立后1d,除了海馬存在棘波放電外,紋狀體和大腦皮質(zhì)可記錄到稀少的與海馬棘波同步的棘波放電。模型建立后3d,除了海馬密集的癲癇波外,紋狀體和大腦皮質(zhì)的棘波逐漸增多,同時(shí),在嗅球可記錄到癲癇波,這些海馬外記錄到的癲癇波與海馬的棘波具有同步性。模型建立后5d至2個(gè)月,在癲癇大鼠的海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)和嗅球均可記錄到較多的癲癇波,但是這些記錄到的癲癇波并不完全同步,模型建立的時(shí)間越長(zhǎng),上述區(qū)域記錄到的棘波放電的同步性就越差。三、ca3組織區(qū)域的病理變化在海人酸注射后6h、1d、3d、5d、7d時(shí),海馬CA3區(qū)域密集的錐體細(xì)胞出現(xiàn)逐漸加重的腫脹、變性和崩解。1周后,CA3區(qū)域的錐體細(xì)胞逐漸減少,注射后4周,在CA3部位的神經(jīng)細(xì)胞幾乎完全缺失,同時(shí),有大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生聚集成膠質(zhì)團(tuán)塊(圖1)。注射對(duì)側(cè)的相應(yīng)區(qū)域亦出現(xiàn)類似的病理變化,但出現(xiàn)相對(duì)晚些,同時(shí),亦不如注射側(cè)嚴(yán)重。海馬齒狀回的神經(jīng)細(xì)胞亦逐漸減少。模型的發(fā)作形式由海人酸制作癲癇模型可分為系統(tǒng)給藥和局部給藥兩種方法,系統(tǒng)給藥操作方便,制作簡(jiǎn)單,被廣為利用。但系統(tǒng)給藥制作癲癇模型的不足也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。首先,系統(tǒng)注射海人酸,藥物通過體循環(huán)后,進(jìn)入大鼠腦組織內(nèi),因此,不同種屬、不同個(gè)體和不同年齡的大鼠對(duì)海人酸的反應(yīng)亦表現(xiàn)出明顯的不同。相同條件的SD大鼠對(duì)海人酸的反應(yīng)就比同樣條件的Wistar大鼠對(duì)海人酸的反應(yīng)遲鈍得多,老年大鼠就比年輕大鼠對(duì)相同劑量的海人酸要敏感得多。這樣就使實(shí)驗(yàn)條件的處理和實(shí)驗(yàn)研究的設(shè)計(jì)變得復(fù)雜。其次,由于系統(tǒng)給藥時(shí),只有不足1%的藥物可以透過血腦屏障進(jìn)入大鼠的腦組織中,與腦內(nèi)的相應(yīng)受體結(jié)合,海人酸價(jià)格昂貴,不難看出其中的浪費(fèi)。而利用立體定向技術(shù),海馬局部按4μg/kg體重注射海人酸,建立大鼠顳葉癲癇模型,雖然操作看似復(fù)雜,卻避免了系統(tǒng)給藥的不足。1972年,Racine提出了記錄癲癇大鼠發(fā)作時(shí)行為學(xué)改變的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):I級(jí),咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐;Ⅱ級(jí),以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉的抽搐;Ⅲ級(jí),單側(cè)前肢的陣攣、抽搐;Ⅳ級(jí),雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起;V級(jí),雙側(cè)后肢強(qiáng)直、身體背曲強(qiáng)直、跌倒。在本實(shí)驗(yàn)中,大鼠經(jīng)歷癲癇前的頻繁的“濕狗樣抖動(dòng)”之后,即進(jìn)入I級(jí)發(fā)作狀態(tài),很快進(jìn)入Ⅱ級(jí)發(fā)作狀態(tài),同時(shí),I級(jí)和Ⅱ級(jí)發(fā)作狀態(tài)會(huì)有交叉,之后進(jìn)入Ⅲ級(jí)發(fā)作狀態(tài),很快即進(jìn)入Ⅳ級(jí)發(fā)作狀態(tài),Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)發(fā)作狀態(tài)也有交叉,然后,大鼠的癲癇發(fā)作進(jìn)入V級(jí)狀態(tài)。整個(gè)的點(diǎn)燃過程經(jīng)歷了從I級(jí)到V級(jí)的發(fā)作,點(diǎn)燃成功后,癲癇大鼠每周出現(xiàn)1～3次I級(jí)到Ⅳ級(jí)的不同形式的發(fā)作,具有了癲癇的長(zhǎng)期敏感性。實(shí)際上,從發(fā)作形式上看,模型模擬了人類顳葉癲癇從“口唇的自動(dòng)癥、涎分泌等植物神經(jīng)癥狀、頭部的自動(dòng)癥”到“單側(cè)上肢的抽搐、雙側(cè)上肢的抽搐”,最后擴(kuò)展到“下肢陣攣、身體強(qiáng)直陣攣”的全部發(fā)作過程,模型的發(fā)作形式與人類顳葉癲癇的發(fā)作形式極為一致。本模型中,海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞和海馬齒狀回的神經(jīng)細(xì)胞在海人酸注射后,伴隨著癲癇發(fā)作,逐漸缺失減少,最后CA3區(qū)域的神經(jīng)元幾乎全部缺失。海人酸是從日本的一種天然海藻中提取的興奮性氨基酸-谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,注射后,與海馬齒狀回中顆粒細(xì)胞的軸突末梢上的海人酸受體結(jié)合,增加突觸末梢膜的通透性,使顆粒細(xì)胞中的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)-谷氨酸大量釋放、重吸收減少,引起突觸后神經(jīng)元-海馬CA3區(qū)域的錐體細(xì)胞的過度興奮毒性,連同谷氨酸本身對(duì)CA3區(qū)域的錐體細(xì)胞的興奮毒性作用,使CA3區(qū)域的錐體細(xì)胞逐漸減少甚至完全缺失。海馬齒狀回中有大量的中間神經(jīng)元,包括γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,這些中間神經(jīng)元聯(lián)系廣泛,代謝活躍,因此對(duì)氧的變化非常敏感。每一次癲癇發(fā)作均會(huì)使腦組織出現(xiàn)乏氧的情況,使海馬齒狀回中的中間神經(jīng)元因缺氧而出現(xiàn)水腫、變性甚至死亡,因此,在模型的病理改變中,可以觀察到齒狀回神經(jīng)元的逐漸減少缺失。在模型的病理變化中,尚可觀察到神經(jīng)元缺失的區(qū)域出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生,形成膠質(zhì)團(tuán)塊。這樣的病理改變同人類顳葉癲癇的病理變化——海馬硬化極其一致。成功的癲癇模型,其發(fā)作形式和腦電活動(dòng)必須與人類一致,至少要有腦電的癲癇改變。本模型中,癲癇的棘波放電起源于一側(cè)海馬,然后迅速在邊緣系統(tǒng)中傳播擴(kuò)布,并可擴(kuò)布到全腦的皮質(zhì),引起相應(yīng)的一次顳葉癲癇發(fā)作。其癲癇之異常電活動(dòng)的形式與人類顳葉癲癇也是一致的。海人酸引發(fā)的顳葉癲癇發(fā)作具有長(zhǎng)期的癲癇敏感性。首先,海人酸本身的神經(jīng)興奮毒性和其引起的傳導(dǎo)性神經(jīng)興奮毒性使海馬內(nèi)的興奮-抑制平衡遭到破壞,引發(fā)癲癇發(fā)作,造成海馬神經(jīng)元的減少、缺失以及隨后的膠質(zhì)細(xì)胞增生。其次,在海馬神經(jīng)元的減少中,齒狀回中以γ-氨基丁酸能神經(jīng)元為主的抑制性中間神經(jīng)元的減少又使海馬內(nèi)的興奮-抑制平衡進(jìn)一步破壞,這樣,海馬神經(jīng)元的減少和缺失便從癲癇發(fā)作的結(jié)果變成了再次癲癇發(fā)作的原因,如此以來(lái),興奮-抑制平衡的破壞和海馬神經(jīng)元的減少