靶向小分子酪氨酸激酶抑制劑在晚期非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

靶向小分子酪氨酸激酶抑制劑在晚期非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

近年來(lái)，表面生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（egfr-tki）被廣泛用于非小細(xì)胞肺癌（gsc）患者的治療。EGFR-TKI能有效地延緩?fù)砥贜SCLC的進(jìn)展并延長(zhǎng)生存期。EGFR-TKI的療效在很大程度上取決于EGFR的突變狀態(tài),同時(shí)與EGFR突變序列的豐度有較高的相關(guān)性。目前,EGFR突變的檢測(cè)方法仍以組織檢查為金標(biāo)準(zhǔn),但組織標(biāo)本突變檢測(cè)因獲取的組織量不足或組織部位不理想有一定的局限性。細(xì)胞學(xué)EGFR突變檢測(cè)方興未艾,作為組織標(biāo)本突變檢測(cè)的補(bǔ)充,獲得良好的臨床效果。近年來(lái)大量研究表明,外周血EGFR突變的檢測(cè)與組織EGFR突變檢測(cè)有較高的符合率,用外周血檢測(cè)EGFR基因突變情況是可行的,并可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展,較早發(fā)現(xiàn)獲得性耐藥。本文主要對(duì)EGFR突變的定性及定量檢測(cè)方法的應(yīng)用和研究進(jìn)展作一綜述。1egfr突變?cè)缙谂R床研究顯示,女性、亞裔、非吸煙、腺癌的NSCLC患者對(duì)吉非替尼(Gefitinib,易瑞沙)有較高的反應(yīng)率。其后發(fā)現(xiàn),EGFR突變與吉非替尼的療效具有明顯的相關(guān)性。EGFR突變主要包括4種類型:外顯子19缺失突變、外顯子21點(diǎn)突變、外顯子18點(diǎn)突變以及外顯子20插入突變。突變使EGFR活性增加,下游增殖通路被高度激活。研究顯示,外顯子19缺失和21點(diǎn)突變?yōu)樽畛Ｒ姷腅GFR突變類型,其中外顯子19缺失占突變總數(shù)的48%,外顯子21點(diǎn)突變占突變總數(shù)的43%。不同的突變類型對(duì)EGFR-TKI具有不同的敏感性。Mitsudomo等總結(jié)了EGFR突變和TKI療效的報(bào)告顯示,外顯子19缺失的有效率為81%,外顯子21點(diǎn)突變的有效率為71%,外顯子18點(diǎn)突變的有效率為56%。最近的大型Ⅲ期臨床試驗(yàn)包括WJTOG3405、IPASS和NEJ002等均顯示,EGFR突變陽(yáng)性的NSCLC患者應(yīng)用TKI在無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)方面明顯優(yōu)于以鉑類為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)兩藥方案。2011年NCCNNSCLC治療指南已推薦將EGFR-TKI用于EGFR突變陽(yáng)性的晚期NSCLC患者的一線治療中。2樣品的egfr突變?cè)囼?yàn)2.1egfr突變檢測(cè)目前,肺腺癌患者的EGFR突變檢測(cè)已經(jīng)應(yīng)用于治療方案的確定和特定臨床試驗(yàn)患者的招募中,但要將EGFR突變檢測(cè)作為治療方案選擇的標(biāo)準(zhǔn),需要找到一種更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速的方法。直接測(cè)序法是基因突變檢測(cè)的經(jīng)典方法,主要用來(lái)檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)未知突變。然而這一技術(shù)在對(duì)已知基因突變的檢測(cè)時(shí)有一定的缺陷。首先,直接測(cè)序法需要多個(gè)步驟,如DNA提取、基因擴(kuò)增、DNA排序以及序列判讀等,而且從標(biāo)本的獲取到獲得檢測(cè)結(jié)果通常需要幾天。其次,直接測(cè)序法的靈敏度較低,需要>25%的突變等位基因。近年來(lái),開發(fā)出了多種以PCR為基礎(chǔ)的EGFR突變的檢測(cè)方法,在靈敏度、縮短分析時(shí)間等方面均優(yōu)于直接測(cè)序法。Pao等總結(jié)比較了EGFR突變檢測(cè)的方法。見表1。除上述方法外,近年來(lái)又出現(xiàn)較多新的EGFR突變的檢測(cè)方法。Hlinkova等提出將高分辨熔解曲線(HRM)技術(shù)與me-PCR技術(shù)相結(jié)合的新型突變檢測(cè)技術(shù),主要原理是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異對(duì)樣本進(jìn)行分析,能夠分辨0.1℃差異,使分辨精度達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分,具有很高的敏感性、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。Minarik等提出將高分辨毛細(xì)管電泳芯片(high-resolutionchipCE)技術(shù)應(yīng)用于EGFR突變的檢測(cè)。該方法包括片段分析和變性毛細(xì)管分析,其主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便、分析迅速和所需組織量少。片段分析用于19外顯子缺失突變檢測(cè),變性毛細(xì)管分析用于21外顯子點(diǎn)突變檢測(cè),上述方法靈敏度較高,可檢測(cè)出5%的突變DNA,僅需12min,大大提高了分析速度。Zhao等提出將me-PCR和ARMS實(shí)時(shí)PCR(ARMS-PCR)聯(lián)合應(yīng)用于EGFR突變的檢測(cè),同時(shí)用此方法對(duì)73例NSCLC患者進(jìn)行檢測(cè),其中31例樣本曾行直接測(cè)序法檢測(cè),對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果顯示,19、21外顯子突變檢測(cè)的符合率分別為96.7%和93.5%。研究結(jié)果同時(shí)顯示聯(lián)合法的敏感度較高,可檢測(cè)出0.1%的突變DNA。2.2樣品的egfr突變定性檢測(cè)2.2.1fish的應(yīng)用FISH是一種使用熒光標(biāo)記的DNA探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色體改變的技術(shù),能夠檢測(cè)不同的細(xì)胞遺傳學(xué)改變類型,包括異倍體(染色體拷貝數(shù)目的異常)、復(fù)制、擴(kuò)增、缺失和替換。FISH共有兩種類型探針,一種是染色體計(jì)數(shù)探針(chromosomeenumerationprobes,CEPs),另一種是特定染色體指示探針(locus-specificindicator,LSI)。CEPs用來(lái)檢測(cè)異倍體,而LSI通常用來(lái)檢測(cè)特定基因的缺失、復(fù)制和擴(kuò)增。Zhu等使用FISH法對(duì)159例肺癌患者進(jìn)行了EGFR突變基因拷貝數(shù)的定量測(cè)定,結(jié)果顯示,61例(38%)患者FISH陽(yáng)性,FISH陽(yáng)性者的EGFR-TKI有效率為21%,陰性者為5%(P=0.2)。IPASS研究對(duì)406例患者使用FISH進(jìn)行EGFR突變基因拷貝數(shù)的測(cè)定,結(jié)果顯示,同時(shí)具有EGFR突變陽(yáng)性和基因拷貝數(shù)陽(yáng)性患者的PFS顯著延長(zhǎng)(HR0.48,95%CI:0.34~0.67)。目前,FISH技術(shù)因其準(zhǔn)確、客觀、特異的優(yōu)勢(shì),已成為EGFR突變定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。但FISH法的缺點(diǎn)在于熒光信號(hào)的不穩(wěn)定性,且必須使用熒光顯微鏡,從而限制了其常規(guī)應(yīng)用;另外FISH技術(shù)無(wú)法進(jìn)行形態(tài)學(xué)及腫瘤異質(zhì)性的檢測(cè)。2.2.2光學(xué)顯微鏡檢測(cè)CISH是一種改良的非熒光原位雜交技術(shù),與FISH的主要區(qū)別在于信號(hào)探針的不同,FISH使用熒光物質(zhì)而CISH使用色素作為信號(hào)探針。CISH使用與堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶共軛的抗體或抗生物素蛋白來(lái)產(chǎn)生類似于免疫組織化學(xué)的發(fā)光反應(yīng),從而可以使用光學(xué)顯微鏡來(lái)進(jìn)行基因突變的定量測(cè)定。與熒光顯微鏡相比,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室更熟悉光學(xué)顯微鏡的使用,可以為不同的實(shí)驗(yàn)室提供更穩(wěn)定的結(jié)果比較。Yoo等分別使用CISH和FISH法對(duì)227例患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè),結(jié)果顯示,兩種方法有較高的符合率,Kappa值為0.83。若以FISH法為金標(biāo)準(zhǔn),CISH法的靈敏度為90.4%,特異度為90.9%。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果顯示,CISH法在不同的觀察者間的符合率為95%,觀察者自身符合率為97.4%。2.2.3ct值的檢測(cè)FQ-PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、可實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、抗PCR污染性等特點(diǎn)。Ct值是指在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的相對(duì)豐度。此方法可以檢測(cè)EGFR突變的相對(duì)豐度,不同的突變豐度與EGFR-TKI療效存在相關(guān)性。Zhou等使用ARMS-PCR和直接測(cè)序法分別對(duì)100例NSCLC患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè),結(jié)果顯示,EGFR突變豐度高的患者PFS明顯優(yōu)于EGFR突變豐度低的患者(11.3個(gè)月vs.6.9個(gè)月),突變豐度低的患者PFS明顯優(yōu)于野生型患者(6.9個(gè)月vs.2.1個(gè)月)。3egfr突變檢測(cè)CT、超聲引導(dǎo)下的細(xì)針抽吸以及胸水送檢等細(xì)胞學(xué)方法是晚期無(wú)法手術(shù)的肺癌患者的主要診斷途徑。由于細(xì)胞學(xué)方法獲得標(biāo)本量較少,限制了將其廣泛應(yīng)用于EGFR突變檢測(cè)當(dāng)中,然而對(duì)于大量晚期肺癌患者,細(xì)胞學(xué)標(biāo)本往往是唯一獲得的病理材料,如何使用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變情況檢測(cè)成為近年來(lái)研究的又一熱點(diǎn)。Billah等進(jìn)行的一項(xiàng)研究共收集了209例肺癌患者的細(xì)胞學(xué)樣本,使用PCR結(jié)合直接測(cè)序法進(jìn)行EGFR突變檢測(cè),其中99例為超聲引導(dǎo)下經(jīng)氣管細(xì)針抽吸(endobronchialultrasound-guidedfine-needleaspiration,EBUS-FNA),67例為CT引導(dǎo)下FNA,27例為胸水或心包積液,10例為超聲引導(dǎo)下FNA,2例為肺泡、氣管沖洗。結(jié)果顯示,總體標(biāo)本不足率僅為6.2%,且EBUS、胸水或心包積液的細(xì)胞學(xué)樣本較其他標(biāo)本有更低的標(biāo)本不足率。EGFR突變總體檢出率為19.4%(34/175),腺癌患者中檢出率為29%(29/100)。Lozano等同樣使用PCR結(jié)合直接測(cè)序法對(duì)收集的150例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變檢測(cè),其中120例為巴氏染色涂片(80%),10例細(xì)胞蠟塊(7%),9例新鮮標(biāo)本(6%),5例胸腔積液(3.3%),其他標(biāo)本6例(4%)。結(jié)果顯示,EGFR突變檢出率為17%(26/110),陽(yáng)性突變者EGFR-TKI有效率為75%。Simone等使用CISH法對(duì)33例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGHR突變定量檢測(cè),并與FISH法進(jìn)行比較,33例均為細(xì)胞蠟塊標(biāo)本。結(jié)果顯示EGFR突變的CISH陽(yáng)性率為82%(27/33),與FISH法的符合率為97%(Kappa=0.78,P<0.0001),若以FISH法為金標(biāo)準(zhǔn),CISH法的靈敏度為67%,特異度為100%。4組織標(biāo)本的獲得及價(jià)值組織標(biāo)本作為EGFR突變檢測(cè)材料固然準(zhǔn)確可靠,但是NSCLC在確診時(shí)超過(guò)70%患者已為ⅢB期、Ⅳ期,大部分不能手術(shù),腫瘤組織難以獲取。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者嘗試通過(guò)經(jīng)支氣管纖維鏡、經(jīng)皮肺穿刺活檢或胸腔積液標(biāo)本來(lái)進(jìn)行突變檢測(cè),但仍不能覆蓋所有晚期患者。即使前瞻性臨床研究最終能利用組織標(biāo)本進(jìn)行有效檢測(cè)的幾率亦僅為30%~40%。如IPASS研究入組1217例患者,經(jīng)篩選僅437例患者可進(jìn)行EGFR突變檢測(cè),篩選成功率僅為35.9%。而且腫瘤的生物學(xué)特性在經(jīng)過(guò)一系列治療后可能已經(jīng)發(fā)生改變,故每次治療前實(shí)時(shí)獲得腫瘤信息才能較準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞特性,疾病進(jìn)展后再次獲取組織標(biāo)本可謂難上加難。研究證明,正常人、良性疾病患者以及惡性腫瘤患者的外周循環(huán)血中存在微量的DNA,其中正常人以及良性疾病患者循環(huán)血中的核酸主要來(lái)源于自身的淋巴細(xì)胞,而惡性腫瘤患者循環(huán)血中的核酸除少部分由淋巴細(xì)胞釋放產(chǎn)生外,大部分來(lái)源于原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死或轉(zhuǎn)移過(guò)程中循環(huán)血中瘤細(xì)胞的裂解釋放,外周血游離核酸與原發(fā)腫瘤的基因組DNA具有相同的遺傳變異。因此,外周血有望替代組織成為EGFR突變情況檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便、有效的方法。4.1應(yīng)用基因質(zhì)譜分析技術(shù)檢測(cè)egfr突變目前應(yīng)用于外周血EGFR突變的檢測(cè)方法主要有變性高效液相色譜法(DHPLC)、突變富集PCR、Scorpions擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(Scorpions-ARMS)等。大量研究表明,外周血EGFR突變的檢測(cè)與組織EGFR檢測(cè)有較高的符合率,用外周血DNA檢測(cè)EGFR基因突變情況是可行的。見表2。除上述方法外,Brevet等將基因質(zhì)譜分析技術(shù)和me-PCR聯(lián)合應(yīng)用于血漿EGFR突變情況的檢測(cè),并對(duì)EGFR突變情況與總體生存期(OS)的關(guān)系進(jìn)行了評(píng)價(jià)。共檢測(cè)了31例患者血漿樣本的EGFR突變情況,其中10例血漿樣本顯示EGFR突變陽(yáng)性,這10例患者中8例組織檢測(cè)為陽(yáng)性,陽(yáng)性符合率為80%。EGFR突變陽(yáng)性患者相對(duì)于突變陰性患者具有較好的總生存期(P=0.01)。Nakamura等使用MBP-BP技術(shù),對(duì)19例確定為EGFR-TKI治療獲得性耐藥的肺腺癌患者的血漿樣本進(jìn)行T790M突變測(cè)定,以期望找到一種可以早期發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI獲得性耐藥的有效方法。結(jié)果顯示,19例患者中有10例T790M突變陽(yáng)性,陽(yáng)性率為53%。4.2微流體數(shù)字pcr的敏感性和特異性目前關(guān)于在外周血中定量檢測(cè)EGFR突變的研究較少,Yung等指出使用微流體數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行外周血EGFR突變的定性及定量檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性。與直接測(cè)序法的結(jié)果相比,微流體數(shù)字PCR技術(shù)的敏感性和特異性分別為92%和100%。突變序列的血漿濃度變化與EGFR-TKI的療效密切相關(guān),共對(duì)10例患者進(jìn)行了EGFR突變序列的定量測(cè)定,其中5例患者在EGFR-TKI治療前留有血漿樣本,4例患者在治療后出現(xiàn)了顯著的突變序列豐度降低,此4例患者中,1例獲CR,3例PR,有效率為100%。5egfr突變檢測(cè)tki的應(yīng)用目前,肺癌的發(fā)病率和病死率仍居惡性