第二章 基因工程的酶學基礎

第二章

基因工程的酶學基礎Enzymes一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）2.性質(zhì)內(nèi)切酶。原核生物。即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。自我保護作用。3.功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基I型限制性內(nèi)切酶

目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型II類限制性內(nèi)切酶

III類限制性內(nèi)切酶

首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌

B株和

K株分離的。（1）識別位點序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶

如EcoB和EcoK。未甲基化修飾的特異序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機理在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。

（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來源無關。2.II類限制性內(nèi)切酶

分離的第一個酶是HindⅡEcoRI5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’

PstI5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GAT

ATC-3’

3’-CTA

TAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識別位點處。（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點）G

AATTC

CTTAA

G

GAATTC

CTTAA

G5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCA

G

②3’端凸出（如PstI切點）G

ACGTC

5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

①連接便利

（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個平齊末端容易的多。③補平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（4）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’

SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’

識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（5）同尾酶(Isocaudamers）5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’

BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’

5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’

BglⅡ5’-U

GATCY-3’3’-YCTAG

U-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5’-

GATC----3’3’----CTAG

-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。

（6）限制酶的酶活性如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應緩沖液。

①星號（*）活性EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！7在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。（7）Ⅱs型限制性內(nèi)切酶移動切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNN

HgaICTGCGNNNNNNNNNN

5’

3’

3.III類限制性內(nèi)切酶

在完全肯定的位點切割DNA，但反應需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+

ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位點在距離識別位點至少1000bp處隨機切開一條單鏈。位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3‘端24—26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：

三、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。4.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2.

用一個右下標的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1.DNA的純度

四、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量③延長保溫時間④

擴大反應體積（>20

l）一般采取大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度

dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?。不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度

是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：

維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。五、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化1.內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式

1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2.完全消化

12341234只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。3.局部消化

123414大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活?；蛴靡掖汲恋鞤NA。4.限制酶酶切反應的終止

5.幾種常用限制酶識別位點6.限制性內(nèi)切酶識別序列的交叉列表

AATTACGTAGCTATATCATGCCGG

******

**MaeIIHpaⅡc

MspIc

***

*AluI****

A

****TNlaⅢ

A*

***TApoI

HindⅢ

AflIII

AgeIBsrFIA**

**TA***

*TSspIA****

TAATTACGTAGCTATATCATGCCGGA****

TNsp7524C

****GNcoIStyIDsaI

XmaIAvaIC*

***GNdeIC**

**GPmlIBsaAIPvuIINspBII

SmaIC***

*GC****

GG

****CEcoRIApoINgoMIBsrFIAATTACGTAGCTATATCATGCCGGG*

***CBseHIG**

**CEcl136IIEcoRV

NaeIG***

*CG****

CAatIISacIBanIIHgiAIBsp1286

SphINsp7524T

****ABspHIBspMIIT*

***AT**

**ASnaBIBsaAI

T***

*AT****

ACGCGCTAGGATCGCGCGGCC

****MboIc

Sau3AIc

**

**BfaIHinpI***

*BstUIDpnIHaeIII****

HhaIA

****TA*

***TMluIAflIIISpeIBglIIBstYIA**

**TA***

*TEco47IIIStuIA****

T

CGCGCTAGGATCGCGCGGCCA****

THaeIIC

****GDsaIAvrIIStyIEagIEaeIGdiII

C*

***GC**

**GNspBIIC***

*GSacIIPvuIC****

GBsiEIBsiEIG

****CBssHIINheIBamHIBstYIKasIBanIBsp120ICGCGCTAGGATCGCGCGGCCG*

***CNarIBsaHIG**

**CG***

*CG****

CT

****ABbeIHaeIIApaIBanIIBsp1286

T*

***AXbaIBclIEaeIT**

**ANruIFspIMscIT***

*AT****

AGTACTATATCGATGCATTAA

******

**Csp61TaqIMseI***

*RsaI****

A

****TA*

***TA**

**TClaIAseIA***

*TScaIA****

TGTACTATATCGATGCATTAAA****

TNsiIC

****GBsiWISfcIXhoIAvaIAvaISfcIC*

***GC**

**GC***

*GC****

GPstIG

****CAsp718BanISalIApaLIGTACTATATCGATGCATTAAG*

***CAccIAccI

G**

**CBsrl107IHincIIHpaIHincIIG***

*CG****

CKpnIBsp1286HgiAIT

****AT*

***ABstBIT**

**ADraIT***

*AT****

A從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一定有斷口。（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應的機理2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸

-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸

-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。連接酶反應的最佳溫度是37

C。四、連接反應的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用

4~16

C。增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例

2.反應溫度12.5℃。五、影響連接反應的因素10~20倍。一般14~16℃第三節(jié)DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5’

3’外切酶活性位于N端。

③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’

3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③

帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應條件-OH5’

3’

dNTPs標記①

核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’

3’

③DNA聚合酶I對探針序列的標記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5’

3’外切酶活性和5’

3’的聚合酶活性（以及3’

5’外切酶活性）。5’

3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3’一側(cè)補上一個新的核苷酸。切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進行切口轉(zhuǎn)移一種

-32P-dNTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記82.Klenowfragment具有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性。（失去了5’

3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolI

Klenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶①3’端補平5’

5’

klenow②DNA3’末端標記補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標記的DNA

限制性內(nèi)切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1h③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’

3’

3’

5’

5’

3’

引物（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’

5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’

5’

（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’

5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’

3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’

5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’

3’聚合）5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

內(nèi)切酶切無dNTPsa.放射性標記的優(yōu)缺點：制作簡單、高比放射性、放射自顯影效果好。優(yōu)點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對人體有害。要求在專門實驗室操作。b.非放射性標記i）生物素標記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP?；Y(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉(zhuǎn)移生物素-dTTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素摻入DNA探針中光促生物素標記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接臂光敏基因+光照抗生物素蛋白（avidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的識別——親和素：是一種雞卵清蛋白。細菌中avidin的類似物。能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：ii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標記的DNA探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒(kit)。地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體。iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反應，反應的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。酶的作用：化學發(fā)光底物HRPO和AP的顯色反應底物發(fā)光反應機理iv）用非放射性標記的探針檢測原理生物素探針序列待測基因親和素酶底物中間產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光探針DNA用生物素或地高辛標記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個發(fā)光或顯色反應。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。核酸探針雜交篩選法的缺點是：只檢測是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達出產(chǎn)物。4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’

3’聚合酶和3’

5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。②3’

5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙②進行末端標記①

以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。5.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除3’

5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序雙脫氧法。②

標記DNA3’隱蔽末端③更有效地補平末端6.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由

和

兩條多肽鏈組成。①

鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和

RNaseH活性。RNaseH：

鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以5’

3’或3’

5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②

鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’

3’DNA外切酶活性。①

合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結(jié)合）。AAAAATTTTT5’

3’

mRNA5’

cDNA②

合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）③RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基。3.特性（1）