漁用枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗

漁用枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展和水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境惡化，水生動物病蟲害頻繁發(fā)生。1材料表面1.1病毒枯草芽孢桿菌,威海海洋職業(yè)學院海洋生物與醫(yī)藥系微生物實驗室自南美白對蝦養(yǎng)殖池底分離保藏。1.2培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):胰蛋白胨10g,氯化鈉10g,酵母浸出粉5g,pH值為7.2;碳源基礎培養(yǎng)基:酵母粉0.1%,氯化鈉1%,pH值為7.0;氮源基礎培養(yǎng)基:葡萄糖5%,氯化鈉1%,pH值為7.0;無機鹽基礎培養(yǎng)基:葡萄糖5%,酵母粉0.1%,pH值為7.0;種子培養(yǎng)基121℃、0.11MPa滅菌20min,其余含糖培養(yǎng)基115℃、0.07MPa滅菌15min。1.3試劑及儀器蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、硫酸銨、硫酸銅,國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn);硫酸鎂、氯化錳,天津市光復科技發(fā)展有限公司生產(chǎn);硝酸鈉、亞硝酸鈉,天津市大茂化學試劑廠生產(chǎn);磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鐵、氯化鈉,天津科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn);蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉,北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);綿白糖,營口北方糖業(yè)有限公司生產(chǎn);魚粉,山東省榮成市海產(chǎn)品有限公司魚粉廠生產(chǎn)。1.4實驗儀器和儀器電子天平(型號為BS2202S),購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;磁力攪拌器(型號為HJ-4),購自金壇市天竟實驗儀器廠;恒溫培養(yǎng)振蕩器(型號為ZWY-211B),購自上海智城分析儀器制造有限公司;高壓蒸氣滅菌鍋(型號為XFH-50CA),購自浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;可見分光光度計(型號為V-1200),購自翱藝儀器(上海)有限公司。2方法2.1培養(yǎng)、活化菌種取一環(huán)凍存菌液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)20h,活化菌種。然后用接種環(huán)蘸取菌落較大的活化菌種于盛有100mL種子培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中180r/min、37℃培養(yǎng)20h。2.2無機鹽基礎培養(yǎng)基碳源基礎培養(yǎng)基中分別添加5%蔗糖、綿白糖、麥芽糖、葡萄糖、紅糖、可溶性淀粉;氮源基礎培養(yǎng)基中分別添加0.5%蛋白胨、牛肉浸粉、花生餅粉、酵母浸粉、魚粉、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉;無機鹽基礎培養(yǎng)基中分別添加1%氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸銅、氯化鐵。接種2%的含菌種子培養(yǎng)基于滅菌的裝液量為200mL的500mL三角燒瓶中,37℃、180r/min培養(yǎng)36h,每個培養(yǎng)基做3個平行,根據(jù)生物量優(yōu)化碳源、氮源、無機鹽種類。2.3最優(yōu)金屬培養(yǎng)基的添加量設計在上述試驗結(jié)果的基礎上,碳源基礎培養(yǎng)基分別添加1%、3%、5%、7%、9%、11%的最優(yōu)碳源;氮源基礎培養(yǎng)基分別添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%的最優(yōu)氮源,無機鹽基礎培養(yǎng)基分別添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%、1.40%的最優(yōu)無機鹽。接種2%的種子培養(yǎng)基于滅菌的裝液量為200mL的500mL三角燒瓶中,37℃、180r/min培養(yǎng)36h,每個條件做3個平行,依據(jù)生物量優(yōu)化碳源、氮源、無機鹽的添加量。根據(jù)單因素試驗的碳源、氮源、無機鹽添加量的結(jié)果,設計正交試驗L2.4最優(yōu)初始ph值的確定以不同的初始pH值(4,5,6,7,8,9,10),按照優(yōu)化好的培養(yǎng)基配方,接種2%的種子培養(yǎng)基于滅菌的裝液量為200mL的500mL三角燒瓶中,37℃、180r/min培養(yǎng)36h,每個條件做3個平行,依據(jù)生物量判斷最優(yōu)初始pH值。在最優(yōu)的初始pH值下,考察不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%、12%)對生物量的影響;在最優(yōu)的pH值和接種量下,考察不同的培養(yǎng)溫度(28,31℃,34,37,40℃)對生物量的影響;在最優(yōu)的pH值、接種量和培養(yǎng)溫度下,考察不同的轉(zhuǎn)速(120,140,160,180,200,220r/min)對生物量的影響;在最優(yōu)的pH值、接種量、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速下,考察不同培養(yǎng)時間(0,2,4,6,8,10,12,……50h)對生物量的影響。2.5生物量測量以未接種的培養(yǎng)基作空白對照,測定OD2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用GraphPadPrism5軟件整理試驗數(shù)據(jù)及作圖,采用IBMSPSSStatistics22.0軟件進行方差分析,采用F檢驗對正交試驗結(jié)果進行差異顯著性分析,數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。3結(jié)果與分析3.1培養(yǎng)基制備的組成的優(yōu)化3.1.1蔗糖和麥芽糖對枯草芽孢桿菌生長的影響由圖1可知,影響枯草芽孢桿菌生長的碳源依次為綿白糖>蔗糖、麥芽糖>葡萄糖>紅糖>可溶性淀粉。蔗糖和麥芽糖對枯草芽孢桿菌生長的影響大于紅糖,這可能是由于紅糖中雜質(zhì)較多,某些成分抑制了菌體的生長。另外,單糖(葡萄糖)和二糖(蔗糖、麥芽糖)對枯草芽孢桿菌生長的影響大于多糖(可溶性淀粉)。因此,選擇綿白糖作為最優(yōu)碳源。3.1.2氮源對枯草芽菌的生長影響由圖2可知,對枯草芽孢桿菌生長影響最大的氮源為魚粉,其次是酵母浸粉和黃豆粉,有機氮OD3.1.3無機鹽對枯草芽菌的生長的影響由圖3可知,對枯草芽孢桿菌生長影響最大的無機鹽種類為磷酸氫二鉀,OD3.2干預培養(yǎng)基成分的含量3.2.1添加碳源對枯草芽菌的生長影響由圖4可知,隨著綿白糖添加量的增加,枯草芽孢桿菌的生物量先升高后降低,當添加量為7%時枯草芽孢桿菌的生物量OD3.2.2氮粉添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響由圖5可知,魚粉添加量≤3%時,枯草芽孢桿菌生物量增幅緩慢,當魚粉添加量為4%時,生物量較3%時明顯增長,當魚粉添加量在5%~9%時,枯草芽孢桿菌生物量增幅較慢,魚粉添加量≥10%時,生物量開始下降,這可能是由于魚粉中的某些物質(zhì)累積量過高時抑制了枯草芽孢桿菌的生長。因此,從經(jīng)濟的角度出發(fā),選擇4%的魚粉添加量為宜。3.2.3枯草芽孢桿菌添加量單因素試驗結(jié)果由圖6可知,當磷酸氫二鉀添加量為0.10%時,枯草芽孢桿菌生物量增幅最大,此后隨著添加量的增加,枯草芽孢桿菌的生物量先小幅增加后趨于平穩(wěn),當添加量超過1.00%時,枯草芽孢桿菌生物量開始急劇下降。綜合考慮,選擇0.15%的磷酸氫二鉀為適宜添加量。3.2.4枯草芽孢桿菌最佳配方優(yōu)化試驗設計在單因素試驗的基礎上,設計正交試驗(見表1),研究綿白糖(A)、魚粉(B)和磷酸氫二鉀(C)3因素最優(yōu)組合水平,得出適合枯草芽孢桿菌生長的最優(yōu)配方組合。正交試驗設計及結(jié)果分析見表1,方差分析見表2。由表1可知,通過極差分析,R由表2可知,通過方差分析,魚粉、綿白糖的P值均<0.01,對枯草芽孢桿菌生長量影響極顯著,而磷酸氫二鉀的P值>0.05,對枯草芽孢桿菌生長量影響不顯著。3.3培訓條件的優(yōu)化3.3.1ph值的初始優(yōu)化由圖7可知,在初始pH值為7時,枯草芽孢桿菌的生物量最大,OD3.3.2接種量對枯草芽孢桿菌生長的影響由圖8可知,隨著接種量的增加,枯草芽孢桿菌的生物量隨之升高,當接種量≥6%時,枯草芽孢桿菌的生物量趨于平穩(wěn),因此選擇6%為最適接種量。3.3.3溫度優(yōu)化由圖9可知,隨著培養(yǎng)溫度的升高,枯草芽孢桿菌的生物量隨之升高,當溫度為37℃時,生物量達最高值,OD3.3.4優(yōu)化速度由圖10可知,隨著轉(zhuǎn)速的增加,枯草芽孢桿菌的生物量逐漸升高,當轉(zhuǎn)速為200r/min時,生物量最高,OD3.3.5枯草芽孢桿菌生長期及數(shù)量測定由圖11可知:在0~8h,枯草芽孢桿菌生物量增加緩慢,處于延遲期;在8~32h,枯草芽孢桿菌生物量急劇增加,處于對數(shù)期;在32~40h,生物量趨于平穩(wěn),處于穩(wěn)定期,在此期間可獲得較高的菌體數(shù)量;當培養(yǎng)時間大于40h后,菌體處于衰亡期。因此,選擇最佳的培養(yǎng)時間為32h,此時OD4討論和結(jié)論4.1碳源種類對枯草芽孢桿菌生長的影響微生物在新陳代謝過程中,必須吸收充足的水分以及構(gòu)成細胞物質(zhì)的碳源、氮源以及鈣、鎂、鉀、鐵等多種礦物質(zhì)元素和一些必需的生長輔助因子才能正常生長繁殖。因此,在枯草芽孢桿菌的生長配方優(yōu)化中,選擇3個主要的因素———碳源、氮源和無機鹽作為考察對象。在碳源的考察中,選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和以蔗糖為主要成分同時還有少量雜質(zhì)的綿白糖,含有維生素和微量元素的紅糖及可溶性淀粉,結(jié)果表明,對枯草芽孢桿菌生長的影響綿白糖>蔗糖、麥芽糖>葡萄糖>紅糖>可溶性淀粉。這與秦艷等在氮源的考察中,李情敏等無機鹽在微生物的生長過程中具有調(diào)節(jié)滲透壓、激活酶、維持pH值穩(wěn)定等作用,在配制培養(yǎng)基時,一般傾向于添加磷酸氫二鉀和硫酸鎂等物質(zhì),可同時提供4種需要量較大的元素。對于其他需要量較少的元素,因在其他天然成分、一般化學試劑、天然水中均以雜質(zhì)的形式普遍存在,除非特別的研究,一般沒有專門添加的必要在選定綿白糖、魚粉和磷酸氫二鉀作為枯草芽孢桿菌生長配方的碳源、氮源和無機鹽后,利用單因素試驗,確定了3種成分的最佳含量分別為:綿白糖7%,魚粉4%,磷酸氫二鉀0.15%。最后通過正交試驗L4.2培養(yǎng)條件確定微生物生長與培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、pH值等條件相關(guān),通過前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件不同,培養(yǎng)溫度一般為28~37℃,轉(zhuǎn)速為140~220r/min,接種量為2%~10%、初始pH值為5~8,培養(yǎng)時間為12~36h綜上所述,立足山東沿海地方經(jīng)濟發(fā)展特色,就地取材魚粉,將其與綿白