【安徽】中職農業(yè)生物技術(主編曹春英、丁雪珍第二版高教版)教案：第二章植物組織培養(yǎng)技術04

第三節(jié)植物組織培養(yǎng)操作技術（2）一、授課章節(jié)第三節(jié)植物組織培養(yǎng)操作技術（2）。二、學時安排2學時。三、教學目標1．掌握培養(yǎng)基的作用。2．掌握培養(yǎng)基中生長調控物質的作用。3．了解培養(yǎng)基的類型。四、教學重點、難點分析重點：培養(yǎng)基的基本成分。難點：培養(yǎng)基中生長調節(jié)物質的作用。五、教具電化教學設備。六、教學方法講授法，演示法。七、教學過程Ⅰ.導入培養(yǎng)基是進行植物組織培養(yǎng)的基質，進行植物組織培養(yǎng)必須掌握培養(yǎng)基的基本知識，今天我們就學習培養(yǎng)基的種類和基本成分。II.新課三、培養(yǎng)基制備技術（一）配制培養(yǎng)基的目的配制培養(yǎng)基的目的是人為提供離體培養(yǎng)材料的營養(yǎng)源。配制的不同培養(yǎng)基，是為滿足不同類型植物材料對營養(yǎng)的不同需要。沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一種合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。（二）培養(yǎng)基的種類1

1.培養(yǎng)基的種類劃分固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)。根據(jù)形態(tài)液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中沒有凝固劑為液體狀態(tài)。初代培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)階段培繼代培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。養(yǎng)基本培養(yǎng)基：只含有無機鹽、蔗糖、維生素和水等最基本成分的合基根據(jù)營養(yǎng)水平種完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入適宜的植物激素和有機附加物的培養(yǎng)基。類誘導培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)時誘導外植體生長與脫分化的培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)進程增殖培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)中促進培養(yǎng)物快速增殖的培養(yǎng)基，也稱擴繁培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基：誘導試管苗生根的培養(yǎng)基。2.常用培養(yǎng)基的配方和特點目前已公開報道的基本培養(yǎng)基有許多種類，各有不同的特點和適用范圍，在植物組織培養(yǎng)生產中應根據(jù)不同的植物種類和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的選用不同的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基配方：表1常用培養(yǎng)基配方MSB5WhiteSHVWN6含量（mg/L）KnudsonC（1962（1968（1943（1972（1946）（1949（197）））））4）(NH4)2S04NH4N031345004635001650KN03Ca(N03)2·4H20CaCl2·2H20Ca3(PO4)2MgS04·7H20KH2PO4NaH2P04·H20Na2SO4Na2—EDTAl900250015025015037.3805252500283020010004402004001662003701702502502502501854007201720037.31537.32FeSO4·7H20Fe2(SO4)32027.827.827.82.56525KClFe2(C4H4O6)3NH4H2PO4MnSO4·H20MnS04·4H20ZnSO4·7H20H3B03283001022.38.6102.0534.43.81.60.81.05.01.00.16.23.01.50.75KI0.830.250.750.257.57.5Na2Mo04·2H20MoO3CuSO4·5H20CoCl2·6H200.0010.010.0250.0250.10.0250.0250.20.10.10.30.15.01鹽酸硫胺素VBl101.01.01000.55.00.50.5煙酸0.55.0鹽酸吡哆醇VB61002.01000肌醇32甘氨酸蔗糖pH30000200002000030000200005.820000500005.85.55.65.85.55.8表2常用基本培養(yǎng)基的特點特點基本培養(yǎng)基種類設計由來適用范圍無機鹽和離子濃度較高，為較1962年由Murashige和穩(wěn)定的平衡溶液；它的硝酸鹽廣泛地用于植物的器MSSkoog為培養(yǎng)煙草細胞和銨鹽含量較其他培養(yǎng)基為官、花藥、細胞和原生而設計高，比例也比較合適，不需要質體培養(yǎng)添加更多的有機附加物。除含有較高的鉀鹽外，還含有1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計適合雙子葉植物，尤其B5較低的氨態(tài)氮和較高的鹽酸硫胺素木本植物的培養(yǎng)1943年由White為培養(yǎng)無機鹽數(shù)量較低，提高了White適于生根培養(yǎng)MgSO4的濃度番茄根尖而設計鹽分濃度較高，銨態(tài)氮含量較在不少單子葉和雙子葉低，鹽酸硫胺素和硝酸鉀含量植物的組培中應用效果SH1972年由Schenk和Hidebrandt設計較高較好1922年由Knudson為蘭成分簡單，不能滿足大多數(shù)植適用于蘭科植物種子培KnudsonC科種子培養(yǎng)而設計，后物組織細胞的生長發(fā)育所需的養(yǎng)和萌發(fā)經多次改良Vacin和Went在1949培養(yǎng)基的總離子強度稍低些，磷以磷酸鈣的形式供給營養(yǎng)物質VW適用于氣生蘭的組培年設計3適用于單子葉植物花藥1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計成分較簡單，KN03和(NH4)2S04培養(yǎng)，廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥N6含量高培養(yǎng)（三）培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基主要有水、無機鹽、有機物、植物生長調節(jié)物質、培養(yǎng)基的支持材料五大類組成。1.水水是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以確保母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質，大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。2.無機元素(1)大量元素指濃大度于0.5mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物來提供。(2)微量元素指濃小度于0.5mmol／L的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成必要的。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用。在制作培養(yǎng)基時不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其pH在5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeS04·7H20和Na2-EDTA結合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質會導致生長發(fā)育異常。3.有機化合物(1)糖類：這類有機物的作用一是培養(yǎng)物賴以生長的碳源；二是使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓?！しN類：常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖，麥芽糖、半乳糖、甘露糖等在組織培養(yǎng)中也有應用?！な褂脻舛龋阂话阍?％～3％?！诖笠?guī)模生產時，可用食用的綿白糖代替。（2）維生素類：這類化合物在植物細胞中主要以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用?！しN類：硫胺素(維生素B)、吡哆醇(維生素B)、煙酸(維生素B，又稱維生素PP)、316泛酸(維生素B)、生物素(維生素H)、鈷胺素(維生素B)、葉酸(維生素B）等。115124·使用濃度：0.1～1.0mg/L(3)肌醇(環(huán)己六醇)：·作用：在糖類的相互轉化中起重要作用；參與細胞壁和細胞膜的構建；能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成；對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用。·使用濃度：一般為1OOmg／L。(4)氨基酸：·作用：是很好的有機氮源，可被細胞直接吸收利用?！こＳ梅N類：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有時應用水解乳蛋白（LH）或水解酪蛋白（CH），但由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。(5)天然復合物：成其分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般盡量不使用?！ひ槭且拥囊后w胚乳。它是使用最多、效果最大度在10％～20％。它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。在馬鈴薯莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用，但莖尖組織的大小若超過1mm時，椰乳就不發(fā)生作用。的一種天然復合物，一般使用濃尖分生組織和草莓微莖·香蕉用量為150～200g/L。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對原球莖增殖有明顯促進效果，并有利于壯苗與生根。·馬鈴薯去掉皮和芽后，加水煮30min，經過過濾，取其濾液使用。用量為150～200g／L。添加后可得到健壯的植株。4.植物生長調節(jié)物質植物生長調節(jié)物質是培養(yǎng)基的關鍵性物質，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用，控制著培養(yǎng)物的脫分化、再分化和形態(tài)建成。（1）生長素類：·作用：在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長?！しN類及活性：常用種類有IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等。作用能力的強弱順序為：2，4-D＞NAA＞IBA＞IAA?！し€(wěn)定性：IAA是天然存在的生長素，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解，故要避光貯存，過濾滅菌。其他3種生長素為人工合成，耐高溫高5

壓，不易被分解破壞。特別是NAA穩(wěn)定性好，活性較高，價格低廉，所以應用最普遍。IAA、NAA、IBA配制時可先用少量95％酒精助溶。2，4-D·溶解性：生長素不溶于水，可用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶。（2）細胞分裂素類：·作用：①誘導芽的分化促進側芽萌發(fā)生長，細胞分裂素與生長素相互作用，當組織裂素／生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽。②促進細胞分裂與③抑制根的分化。因此，細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避內細胞分擴大。免在生根培養(yǎng)時使用?！しN類及活性：這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐氨基嘌呤)、Kt(激動素)、能力的強弱順是序：ZT＞6-BA＞KT，常用的是人工合成的、性能穩(wěn)定的、適中的6-BA。Zt(玉米素)等。作用價格·溶解性：細胞分裂素不溶于水，也不溶于酒精，一般可溶于0.1mol/L的鹽酸或NaOH溶液中。（3）赤霉素(GA)：有20多種，培養(yǎng)基中添加的是GA，主要用于促進幼苗莖的伸長生3長，促進不定胚發(fā)育成小植株；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。赤霉素溶于酒精，-100％失效，應當過濾滅菌。生長調節(jié)物質的使用量甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調節(jié)物質的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用0.05～5mg／L，細胞分裂素0.05～10mg／L。5.培養(yǎng)基的其他成分一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。配制時可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％為(1)瓊脂：在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在90℃以上熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在6～10g／L之間。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工時間、pH等因素有關，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。方式有關外，還與高壓滅菌時的溫度、過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比，優(yōu)點在于操作簡便，通氣問題易于解決，便6

于經常觀察研究等，缺點是培養(yǎng)物的吸收面積?。桓鞣N養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產生毒害作用。(2)抗生物質：抗生物質有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg／L之間。添加抗生物質可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但應當注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用。（3）抗氧化物：培養(yǎng)基中添加抗半胱氨酸、維生素C、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）