補骨脂及其與甘草配伍對補骨脂酚在大鼠體內(nèi)的毒性研究

補骨脂及其與甘草配伍對補骨脂酚在大鼠體內(nèi)的毒性研究

補骨脂是一種常見的中藥。具有加熱腎、輔助陽、納氣、止瀉的功效，臨床應(yīng)用非常詳細。但近年已有一些關(guān)于補骨脂臨床不良反應(yīng)(肝、腎毒性)的報道配伍是中醫(yī)用藥的基本形式,甘草為方劑配伍應(yīng)用最普遍的中藥,補骨脂與甘草也經(jīng)常配伍應(yīng)用。中藥配伍存在著復(fù)雜的相互作用,深入研究中藥配伍后活性成分的毒代動力學(xué)變化,對闡明中藥的配伍毒性及指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。近來研究顯示甘草主要成分甘草次酸可抑制肝微粒體多種CYP450同工酶本研究比較了補骨脂單煎液及其與甘草合煎對補骨脂酚毒代動力學(xué)與毒性的影響,為深入研究補骨脂與甘草的配伍毒性提供新的科學(xué)依據(jù)。1材料表面1.1/10萬電子天平/mill-q純水器Agilent1260高效液相色譜儀(VWD檢測器,二元高壓梯度泵,柱溫箱;美國安捷倫公司);1/10萬電子天平(德國賽多利斯公司);渦旋混合器(美國ScientificIndustries公司);ThermoMicroCL21R高速冷凍離心機(美國);Milli-Q純水器(美國);MD200-2氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)。1.2補骨脂素和脂素對總樣的檢測補骨脂(北京三和藥業(yè)有限公司,批號100401),按《中國藥典》2010年版一部檢驗,含補骨脂素和異補骨脂素總量為0.75%,結(jié)果達到藥典要求;甘草(北京三和藥業(yè)有限公司,批號40401002),按《中國藥典》2010年版一部檢驗,含甘草苷0.54%,甘草酸1.5%,結(jié)果達到藥典要求。補骨脂酚對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度99%);馬兜鈴酸A(純度99%)、丹參酮Ⅱ1.3實驗動物及藥物SPF級健康SD大鼠35只,8周齡,雌雄均有,體重約200g,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部,許可證號SCXK(京)2011-0012。2方法2.1動物組和劑量SD大鼠共35只,雄性25只,雌性10只,按照體重、性別將大鼠隨機分為7組,溶劑(蒸餾水)對照組、甘草(20g·kg2.2單次給藥中毒的代動力學(xué)研究2.2.1給藥劑量的選擇2010年版藥典中規(guī)定成人補骨脂每日常用量為6~10g,按成人60kg體重計算,日用量為100~167mg·kg2.2.2給藥體積的測定分別稱取適量補骨脂、補骨脂+甘草、甘草若干,浸泡30min,水煎3次,每次于沸水中煮沸1h,再將3次藥液經(jīng)8層紗布過濾合并,按照給藥體積(10mL·kg2.2.3標準物質(zhì)和內(nèi)標溶液的制備精密稱取補骨脂酚對照品100mg于100mL量瓶內(nèi),甲醇溶解并稀釋至刻度,得到質(zhì)量濃度為1g·L2.2.4血清蛋白的檢測大鼠給藥后,于0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,12,24h內(nèi)眥靜脈取血0.5mL,肝素抗凝,4000r·min2.2.5條件1PhenomenexC2.2.6分離、測定物的測定專屬性考察:分別取5只大鼠空白血漿混合樣品,加入一定量的補骨脂酚對照品及內(nèi)標,按照上述血漿處理方法處理后,HPLC分析。比較其色譜行為,考察內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾補骨脂酚和內(nèi)標物的分離、測定。線性關(guān)系考察:取大鼠空白血漿0.1mL,分別精密加入一定量的補骨脂酚對照品溶液和等量內(nèi)標溶液,旋渦混勻,配成含補骨脂酚質(zhì)量濃度分別為20,50,100,200,500,800,1000μg·L精密度考察:配制補骨脂酚終濃度為50,200,800μg·L提取回收率考察:配制補骨脂酚終濃度為50,200,800μg·L穩(wěn)定性考察:配制補骨脂酚終濃度為50,200,800μg·L樣品測定的質(zhì)量控制:血漿樣品的測定在分析方法驗證完成之后進行,每批血漿樣品測定的同時測定隨行標準曲線及質(zhì)控樣品。2.3腎功能生化指標各組大鼠分別于單次給藥24h后自內(nèi)眥靜脈取血1mL,置肝素化離心管中,離心后取上層血漿測定肝、腎功能生化指標,包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)及腎損傷分子1(Kim-1)水平。分別按試劑盒說明書進行操作。2.4統(tǒng)計學(xué)處理方法測定結(jié)果用ue0af±s表示,毒代動力學(xué)參數(shù)采用DAS2.0軟件進行計算,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。3結(jié)果3.1中毒代理的動態(tài)變化3.1.1保留時間和保留時間對hplc圖譜的影響內(nèi)標與補骨脂酚完全分離且峰形良好,保留時間分別為12.35,10.21min,HPLC圖譜見圖1。血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾補骨脂酚的測定。3.1.2線性關(guān)系和定量限用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算,權(quán)重系數(shù)w=1/X3.1.3分別實行不同的救濟方式,增強對社會穩(wěn)定的認識低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品日內(nèi)精密度RSD分別為4.71%,2.92%,1.90%;日間精密度RSD分別為3.97%,2.07%,1.70%,均小于15%,符合要求。3.1.4提取回收率50,200,800μg·L3.1.5穩(wěn)定性研究血漿樣品室溫(25℃)放置4h、冷凍(-20℃)保存15d、反復(fù)凍融3次,測定的補骨脂酚RSD均小于15%。3.1.6補骨脂水提取物和補骨脂甘草聯(lián)合用藥的小鼠毒代動力學(xué)改變與大鼠單次給予補骨脂24h的補骨脂酚血藥濃度比較,補骨脂和甘草配伍后,補骨脂酚藥時曲線下面積(AUC)、最大血藥濃度(C3.1.7補骨脂-甘草配伍對大鼠ast的影響單次經(jīng)口給予補骨脂單煎液及補骨脂-甘草合煎液,補骨脂-甘草配伍組雄性大鼠的AST升高,但與溶劑對照組比較均無顯著差異,見表2。馬兜鈴酸(0.07g·kg4討論4.1大鼠的毒代動力學(xué)變化補骨脂酚是補骨脂的主要成分,研究證實CYP2C19,2C9和3A4等CYP酶亞型參與了補骨脂酚的肝代謝中藥常為復(fù)方用藥,補骨脂與甘草經(jīng)常配伍應(yīng)用。甘草次酸是甘草的主要活性代謝物,研究Zhuang等結(jié)合柱前衍生化與UHPLC-MS/MS方法對補骨脂酚大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)進行研究,發(fā)現(xiàn)口服補骨脂酚的生物利用度僅為3.2%,可能與補骨脂酚在體內(nèi)較低的吸收率或者大鼠體內(nèi)的一相代謝過程有關(guān)本研究結(jié)果顯示,大鼠單次灌胃補骨脂單煎液及補骨脂-甘草合煎液后,0.08h即可在血液中檢測到補骨脂酚,證實補骨脂酚能迅速被大鼠的胃腸道吸收到達血液,但雌、雄大鼠毒代動力學(xué)參數(shù)明顯不同,雌性大鼠代謝速率慢于雄性大鼠,此性別差異是否與補骨脂中補骨脂酚的雌激素樣作用有關(guān),還有待深入研究。比較分析大鼠灌胃補骨脂-甘草合煎液和等劑量補骨脂單煎液的代謝動力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)甘草成分對補骨脂酚的吸收、分布、消除均有一定程度影響。補骨脂-甘草配伍組大鼠血中補骨脂酚AUC,C4.2補骨脂對大鼠肝腎毒性的影響既往研究顯示補骨脂酚對人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)具有明顯的腎毒性血中尿素氮和肌酐是反映腎功能的指標,腎小球濾過受損較重時尿素氮和肌酐才明顯升高本研究結(jié)果顯示,補骨脂組、補骨脂-甘草配伍組NAG均顯著升高,提示高劑量補骨脂可對大鼠腎小管產(chǎn)生一定的毒性,且補骨脂與甘草配伍組升高程度高于補骨脂組,但二者間無統(tǒng)計學(xué)差異;補骨脂組與配伍組KIM-1水平均升高,但與對照組相比未見顯著差異。綜上所述,補骨脂與甘草配伍使補骨脂酚在大鼠體內(nèi)的