保元抗癌口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高

保元抗癌口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高

寶元抗癌口服是解放軍總醫(yī)院的非標(biāo)準(zhǔn)制劑。這是由黃原、西洋參、半枝蓮和仙鶴草組成的11種中藥組成的。具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、清熱解毒、抗癌作用。主要用于各種腫瘤的治療或腫瘤術(shù)后的恢復(fù)和化療。臨床使用多年，質(zhì)量可靠，療效確切，具有較高的安全性和有效性。保元抗癌口服液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較為落后，有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對處方中黃芪、西洋參進(jìn)行薄層鑒別，無含量測定項。為了加強(qiáng)制劑質(zhì)量控制，滿足中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高要求，本研究嘗試新增白花蛇舌草、半枝蓮、白術(shù)的薄層鑒別，新增黃芪甲苷的含量測定，以期提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到有效控制藥品質(zhì)量的目的。1材料表面1.1超聲儀器和設(shè)備LC-20AT高效液相色譜儀(島津)；YP502N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；列孔型電熱恒溫水浴鍋(天津市中環(huán)科技開發(fā)公司)；GoodLook-1000型全自動薄層色譜成像系統(tǒng)(上?？普苌萍加邢薰?。1.2藥物質(zhì)量、藥材保元抗癌口服液(解放軍總醫(yī)院，批號：190701,190702,190703)；黃芪甲苷對照品(北京曼哈格生物科技有限公司，批號：B0005705；純度：90.6%)；黃芪、西洋、白花蛇舌草、半枝蓮、白術(shù)對照藥材(批號：120974-201311,120997-201309,121183-201404,121203-201003,120925-201611)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙醇、無水乙醇、甲醇、正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚(30～60℃)、環(huán)己烷、硫酸、鹽酸、冰醋酸、氨水、氫氧化、三氯化鋁、對二氨基苯甲醛均為分析純。硅膠G板、聚酰胺薄膜(青島海洋化工廠)。2方法和結(jié)果2.1包裝侵權(quán)2.1.1黃2.1.4陰性樣品溶液取本品10mL，加甲醇30mL，超聲處理30min，放冷，離心，取上清液，濾液蒸干，殘渣加水20mL溶解，超聲10min，放冷，過濾，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。取缺半枝蓮藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取半枝蓮對照藥材1g，加甲醇20mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各1μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(3∶2∶2∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1F。2.1.5檢測方法及設(shè)備取本品20mL，用石油醚(30～60℃)充分振搖2次(25mL,20mL)合并，蒸干，殘渣加0.5mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺白術(shù)藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取白術(shù)對照藥材1g，加水50mL，煎煮30min，放冷，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(7∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱6～8min，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，結(jié)果見圖1G。2.2hplc黃棕櫚葉含量的測定2.2.1在鉻條件下進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗WondaSilC2.2.2對照藥材的制備(1)對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，混勻，即得。(2)供試品溶液的制備：精密量取供試品10.00mL于50mL離心管中，加入30mL水飽和正丁醇溶液，充分萃取5min，靜置分層后，取水飽和正丁醇層于150mL分液漏斗中，水層繼續(xù)用30mL水飽和正丁醇重復(fù)萃取3次，合并正丁醇液于分液漏斗中。用氨試液充分洗滌2次(輕輕振搖防止乳化)，每次40mL，棄去氨試液，正丁醇液于250mL平底燒瓶中，85℃旋蒸至干，放冷，殘渣精密加入5.00mL甲醇溶解，密塞，過0.45μm有機(jī)濾膜，備用。(3)黃芪對照藥材的制備：取黃芪對照藥材細(xì)粉約0.5g(加甲醇25mL，加熱回流提取1h，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30mL使溶解)，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。(4)陰性樣品溶液的制備：取缺少黃芪藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。2.2.3樣品前處理取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品中黃芪甲苷與對照品及對照藥材在相同保留時間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖2。2.2.4加甲醇溶液制備精密稱取黃芪甲苷對照品24.55mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為2224.23μg·mL2.2.6試品溶液制備精密量取樣品(批號：190701)6份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法處理，平行制備6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果表明，黃芪甲苷含量為0.012%,RSD=3.1%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。2.2.7加標(biāo)的回收率測得各添加水平的平均回收率分別為104.0%(RSD=2.6%)、97.6%(RSD=1.5%)、103.0%(RSD=1.4%)，所有加標(biāo)的平均回收率為101.5%(RSD=3.4%)。滿足方法的回收率要求，顯示方法的準(zhǔn)確度良好，回收率均在90%～108%，符合要求。2.2.1穩(wěn)定性試驗將制備好的供試品溶液(批號：190701)和對照品溶液，在室溫放置0,2,4,6,8h后分別按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定黃芪甲苷，供試品溶液和對照品溶液中黃芪甲苷峰面積RSD分別為0.09%和0.08%(n=5)，均<3%，表明上述溶液在室溫放置8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.1樣品中黃芪甲苷含量測定取3批中試樣品(批號：190701,190702,190703)，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，黃芪甲苷含量分別為0.012%,0.011%,0.011%。3討論3.1薄層色譜鑒別為了進(jìn)一步提升標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)本品的制備工藝及藥味的主要成分的化學(xué)性質(zhì)，對方中其他藥味進(jìn)行薄層色譜鑒別篩選研究。參照中國藥典2015年版一部，新增白花蛇舌草、半枝蓮、白術(shù)的薄層鑒別，比移值適中，專屬性強(qiáng)，空白無干擾，可以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中。參照中國藥典2015年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)試驗，仙鶴草3.2化學(xué)成分的檢測黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的作用。主要含有三萜皂苷、黃酮類化合物、多糖以及氨基酸等，為處方中君藥。參照中國藥典2015年版一部，黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定方法，采用蒸發(fā)光檢測器，乙腈-水為流動相，通過多次試驗，調(diào)節(jié)流動相比例、漂移管溫度及載氣量，最終確定檢測條件，結(jié)果黃芪對照藥材溶液在與黃芪甲苷對照品色譜峰相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn)，空白溶劑及陰性對照溶液在黃芪甲苷峰位置處無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，不干擾本品含量測定。為了考察微小變動因素對本品含量測定的影響，調(diào)節(jié)流速(0.8,1.0,1.2mL·min3.3黃芪甲苷的提取、鑒別和鑒別中國藥典2015年版一部中規(guī)定：黃芪藥材中黃芪甲苷含量按干燥品計算，含黃芪甲苷不得<0.04%。處方中黃芪350g，制成口服液1000mL。經(jīng)檢測，黃芪藥材中黃芪甲苷含量0.057%,3批保元抗癌口服液中黃芪甲苷平均含量為0.011g·(100mL)取本品30mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氫氧化鈉試液洗滌2次，每次20mL，棄去氫氧化鈉洗滌液，再用20mL水洗滌正丁醇提取液1次，棄去水洗液，將正丁醇提取液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。取缺少黃芪藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點，且陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1A和1B。2.1.2陰性樣品的檢測取西洋參對照藥材粉末1g，加甲醇25mL，加熱回流提取1h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30mL使溶解，照“2.1.1”項下供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取缺西洋參藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10℃放置12h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點，且陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1C和1D。2.1.3陰性樣品溶液取本品10mL，加乙醇20mL，攪拌搖勻，離心，取上清液置水浴蒸至近干，加硅藻土適量攪勻，干燥，加無水乙醇30mL浸漬30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL溶解作為供試品溶液。取缺白花蛇舌草藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取白花蛇舌草對照藥材1g，加水50mL，回流1h，放冷，過濾，濾液濃縮至約10mL，加乙醇20mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醇-濃氨試液(3∶7.5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以鹽酸乙醇(1→3)溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性樣品無干擾，結(jié)