種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術規(guī)范

種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術規(guī)范范圍本標準規(guī)定了種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化技術規(guī)范。本標準適用于曾祖代、祖代及非免疫父母代種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體病的凈化。本標準不適用于疫苗免疫雞場。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T17999.4SPF雞微生物學監(jiān)測第4部分：SPF雞血清平板凝集試驗NY/T553禽支原體PCR檢測方法NY/T1168畜禽糞便無害化處理技術規(guī)范NY/T5030無公害農產品獸藥使用準則DB34/T2160雞毒支原體感染防治技術DB63/T1652病害動物及病害動物產品無害化處理技術規(guī)程T/CVMA1禽白血病凈化技術規(guī)范世界動物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊術語與定義下列術語和定義適用于本文件。種雞breedingchicken按照動物育種四系配套的原則，將雞的遺傳譜系分為曾祖代、祖代、父母代和商品代，只有曾祖代的雞（原種雞）可以自繁、自養(yǎng)和留種，而其他后代均必須按照四系配套的原則進行育種，且不能留做和它同級的種。種雞（祖代和父母代）是經過不斷地選種和選育，具有一定的生產、生長和遺傳穩(wěn)定性，能夠提供子代，且按照育種組織制訂的標準驗收和鑒定并承認的雞品種。按經濟用途分為蛋用型、肉用型、肉蛋兼用型和觀賞型。家禽疫病凈化poultrydiseaseeradication在一個養(yǎng)禽場或指定的養(yǎng)殖區(qū)域內，通過持續(xù)不斷的檢測和監(jiān)測，及時發(fā)現和淘汰患病禽群或帶菌禽群，并通過及時淘汰感染禽群的方法，以實現根除某種家禽疾病的過程。診斷臨床診斷雞毒支原體病參照DB34/T2160的臨床癥狀和病理變化?；耗抑гw病流行特點感染通常見于4周～16周齡的雞。雞群的患病率一般為5%～10%，病死率不超過10%。臨床癥狀引起的呼吸道癥狀不明顯，受侵害部位在關節(jié)的滑液囊膜及腱鞘。出現關節(jié)腫脹、熱痛、胸部龍骨上水皰、跛行甚至站不起來，從而造成雛雞或青年雞生長發(fā)育受阻，產蛋雞生產性能下降，蛋殼質量變差、易碎。最初癥狀是雞冠蒼白、生長遲緩和關節(jié)腫脹，跗關節(jié)和爪墊是主要感染部位。隨著病情的發(fā)展，出現雞冠萎縮、羽毛粗亂、跛行甚至站立不起。呼吸系統(tǒng)感染滑液囊支原體癥狀輕微，但感染禽是帶菌者。成年雞群感染多表現為蛋殼質量變差、易碎。病理變化病禽主要表現為滑膜炎。在病情較輕時，在腫脹的關節(jié)部位可見到有多量黏稠的滲出液。嚴重時，可見到腱鞘處有黃白色囊狀物，內有白色黏液，關節(jié)滑液囊或腳墊內有黏液性呈灰白色的乳酪樣滲出物，有時關節(jié)軟骨出現糜爛。趾關節(jié)和跗關節(jié)可見有異嗜性白細胞和纖維素浸潤。病原分離培養(yǎng)對可疑雞群進行支原體病原的分離培養(yǎng)，培養(yǎng)基配制、分離部位及培養(yǎng)條件等參照世界動物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊相關內容進行。血清學檢測對種雞群雞毒支原體和滑液囊支原體凝集抗體的檢測，參照GB/T17999.4進行，在2min內出現凝集者為陽性；2min內不凝集者為陰性；介于上述兩者之間為可疑，進行復核試驗，如仍為可疑，判為陽性（見附錄B）。核酸檢測聚合酶鏈式反應（PCR）和環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）方法可任選其一。試劑除非另有說明，僅使用分析純試劑。實驗室用水應符合GB/T6682的要求。2×TaqPCRMasterMixⅡ。10×LAMPAmplificationBuffer，-20℃保存。10mmol/LBetaine溶液：配制見附錄A.1，-20℃保存。BstDNAPolymerase（6U/μL），-20℃保存，避免反復凍融。MgSO4（100mmol/L）：配制見附錄A.2，-20℃保存。dNTP混合液（10mmol/L），-20℃保存，避免反復凍融。SYBRGreenⅠ核酸染料，4℃保存。DNAMarker2000，-20℃保存，避免反復凍融。開蓋后于4℃保存不超過3個月。細菌基因組DNA提取試劑盒，4℃保存。標準菌株，采用的MG標準菌株為F-36株，采用的MS標準菌株為GX11-T株。儀器設備PCR擴增儀。臺式高速冷凍離心機：轉速≥12000r/min。微量移液器：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。電子天平：精度0.01mg。恒溫水浴鍋或恒溫金屬浴。渦旋儀。生物安全柜。電泳儀。紫外透射反射分析儀。樣品處理取咽喉棉拭子。將棉拭子樣品懸浮于1mLPBS溶液中，混勻成懸浮液。DNA提取將棉拭子樣品制成的混懸液4000r/min離心5min，將離心后的上清置于新的1.5mL離心管中，在4℃條件下，12000g離心20min，棄去上清液，并將沉淀物重新懸浮在25μL～50μL的0.1%焦碳酸二乙酯（DEP）水中。按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取DNA。聚合酶鏈式反應（PCR）方法雞毒支原體和滑液囊支原體的PCR檢測方法使用的引物及反應條件等參考NY/T553。環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）方法引物依據雞毒支原體（MG）的mgc2基因序列和滑液囊支原體（MS）的16SrRNA序列，分別設計LAMP引物，擴增長度約200bp。MG-F3：5’-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3’MG-B3：5’-CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3’MG-FIP：5’-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3’MG-BIP：5’-TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3’MS-F3：5’-GCATTAAGCGGATCGGTT-3’MS-B3：5’-AACTGCTGCATCAAGAGC-3’MS-FIP：5’-TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3’MS-BIP：5’-ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3’LAMP反應條件所采用的試劑盒反應體系見表1。禽支原體LAMP反應體系反應組分體積10×AmplificationbufferⅡ2.5μLdNTP混合液（10mmol/L）4.0μLF3/B3（10μmol/L）0.5μL×2FIP/BIP（30μmol/L）1μL×2Betaine（10mmol/L）2μLDNA1μLBstDNAPolymerase（6U/μL）1μLMgSO4（100mmol/L）1μLddH2010.5μL取DNA模板1-5μL置于分別加入雞毒支原體/雞滑液囊支原體LAMP引物已配置好的上述試劑盒體系內，在管蓋內壁加1mL1000×SYBRGreenⅠ，通過染料液滴本身的液體表面張力使得染料附著在管蓋上，從而避免染料在反應過程中接觸反應液抑制反應，關閉管蓋時需注意避免用力過大防止染料滴入反應液。置于63℃水浴鍋中，反應60min，80℃作用10min終止反應。結果判定瞬時離心LAMP反應管，使管蓋內側壁的SYBRGreenⅠ核酸染料與LAMP反應體系充分混勻。在自然光照下，陰性反應管不發(fā)生顏色變化，為橘紅色，陽性反應管內液體變?yōu)辄S色。反應管置于紫外透射反射分析儀下，陰性反應管不顯現熒光，陽性反應管發(fā)出明亮的黃綠色熒光（見附錄C）。凈化檢測規(guī)程曾祖代和祖代雞出殼雛雞的檢測與處置雛雞飼養(yǎng)管理參照T/CVMA1的方法，將種蛋隔離孵化，出殼后小批量隔離飼養(yǎng)，減少孵出的雛雞相互之間的感染機會。樣品的收集采集出殼后的雛雞咽喉棉拭子，置于預先做好標記的1.5mL滅菌離心管，離心管中預先加入0.5mL樣品稀釋液，充分震蕩搖均。每次對一只雞采樣后，應注意更換一次性手套或對雙手進行消毒，方可進行另一只雞采樣，避免產生交叉的污染。核酸檢測和病原鑒定將采集到的樣品一分為二。一部分樣品用于進行PCR或LAMP檢測（二選其一）。PCR按照NY/T553禽支原體PCR檢測方法進行。LAMP檢測按照4.4.6方法進行。一旦發(fā)現樣品的PCR或LAMP檢測陽性，則立即對可疑樣品的備份按照世界動物衛(wèi)生組織（OIE）陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊進行病原分離和鑒定。檢測雞群處置淘汰所有PCR或LAMP檢測陽性以及病原分離陽性的雞，對于PCR或LAMP檢測陽性但病原分離陰性的雞也應淘汰，同時淘汰同居雞。對檢測為陰性的雞群應維持小群飼養(yǎng)。育成期的檢測和處置雞群臨床觀察觀察雞群，對有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑育成期雞進行淘汰。抗體檢測對全群100%采血，進行SPA血清學檢測雞毒支原體和雞滑液囊支原體的抗體。淘汰所有的雞毒支原體和雞滑液囊支原體陽性雞。對可疑的雞群進行下一步的病原核酸檢測。對檢測為陰性的雞群應維持小群飼養(yǎng)?？梢呻u群病原核酸檢測采集可疑雞群的咽喉棉拭子樣品進行PCR或LAMP，分別檢測雞毒支原體和雞滑液囊支原體。檢測雞群處置淘汰所有PCR或LAMP檢測陽性的雞。陰性雞群應小群隔離飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。開產前雞群的檢測和處置雞群臨床觀察觀察開產前雞群，對有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進行淘汰。抗體檢測同5.1.2.2?？梢呻u群病原核酸檢測同5.1.2.3。檢測雞群處置淘汰所有血清學檢測陽性和PCR或LAMP檢測陽性的雞。對檢測為陰性的雞群應維持小群飼養(yǎng)，作為后備育種雞群。留種前的預防用藥和檢測以及處置雞群臨床觀察觀察留種雞群，對有4.1.1或4.1.2臨床癥狀的可疑病雞進行淘汰。雞群檢測在留種前，對全群100%采血。其余的檢測按照5.1.2.2和5.2.2.3進行。淘汰所有PCR或LAMP檢測陽性的雞。對檢測為陰性的雞群作為育種雞群。預防用藥在留種前2周，按照7.2進行選擇用藥。種蛋的選留和孵化按照本標準5.1.1～5.1.4規(guī)定程序淘汰所有的陽性雞后，每只母雞僅選用1只檢測為陰性公雞的精液進行人工授精。按照育種規(guī)定的時間留足種蛋，對每只母雞的種蛋進行標記。將每只母雞的種蛋置于標記有該母雞標號的專用孵化紙袋（紙盒）中，防止不同母雞的種蛋直接接觸，置于孵化器中的特定出雛箱中孵化出雛。種蛋上孵后，在孵化期內提升溫度至45℃，維持14h，以消滅種蛋中可能的支原體，然后轉入常規(guī)的孵化溫度操作。父母代雛雞的檢測和處置采集進場后的雛雞咽喉棉拭子，處理同5.1.1.2，分別進行PCR或LAMP，檢測雞毒支原體和雞滑液囊支原體。淘汰所有PCR或LAMP檢測陽性的雞。育成期雞群的檢測和處置同5.1.2。開產前雞群的檢測和處置同5.1.3。留種前的預防用藥和檢測以及處置同5.1.4。種蛋的選留和孵化按照本標準5.2.1～5.2.4規(guī)定程序淘汰所有的陽性雞后，選用雞毒支原體和雞滑液囊支原體檢測為陰性公雞的精液進行人工授精或自然交配，按照常規(guī)的標準選留種蛋。利用該批種蛋孵化出的雛雞作為雞毒支原體和雞滑液囊支原體凈化后的商品代雞群。凈化周期啟動和終止檢測時間的選擇曾祖代、祖代可以根據種雞所處時期5.1.1～5.1.4的任何一個時間點啟動凈化程序。父母代應在祖代凈化的基礎上，再在5.2.1～5.2.4的任何一個環(huán)節(jié)啟動凈化程序。不同種雞場可以根據其具體條件選擇相關的檢測技術，以提高雞群檢測的準確性，縮短凈化周期。凈化標準評估凈化效果評估應按照國家農業(yè)行業(yè)主管部門制定的雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化評估程序和凈化評估標準。凈化評估標準見附錄D。凈化后檢測比例的調整按照6.2所列要求判定為種雞達到雞毒支原體和雞滑液囊支原體病凈化狀態(tài)的雞群建議不再按照5.1.1～5.1.4或5.2.1～5.2.4的凈化程序進行全部的檢測，轉為按照不低于10%的比例進行抽檢，如果抽檢不符合6.2所列要求，則必須按照5.1.1～5.1.4和5.2.1～5.2.4的程序進行全部的檢測，重新進行凈化。注意事項生物安全種雞場地理位置應相對隔離，遠離其他雞場。在引進種蛋或雞苗前，應先了解種禽場的凈化情況，不能從有疫情的禽場引種。接觸種雞群的工作人員應固定化，避免其他雞群的飼養(yǎng)員進入實施凈化的雞群中工作。禽舍在飼養(yǎng)前需經過垃圾清除、高壓水槍沖洗、福爾馬林熏蒸等消毒措施。應加強飼養(yǎng)管理，降低飼養(yǎng)密度，注意通風，保持舍內空氣新鮮，防止過熱過冷、濕度過高，定期清糞，防止氨氣、硫化氫等有毒有害氣體的刺激等。運送物品車輛以及人員出入，均應執(zhí)行消毒制度，同時應盡可能降低種雞場所需物品與外界的交流。每周進行2次～3次帶雞消毒噴霧，出現疫情時應每天進行帶雞消毒。應堅持“全進全出”制，最大限度地避免多日齡雞群混養(yǎng)。對病死雞、未出殼雞胚、雞糞和孵化場內廢棄物按NY/T1168和DB63/T1652的要求進行無害化處理。藥物的預防藥物的使用應符合NY/T5030的要求。藥物使用應以藥物敏感試驗結果為基礎，選用高敏藥物。推薦藥物：泰樂菌素、泰妙菌素、北里霉素、恩諾沙星等，按標簽說明劑量使用。檔案管理做好種雞雞毒支原體和滑液囊支原體病凈化工作記錄，并歸檔保存。記錄內容包括：平板凝集檢測抗原購進和檢測記錄、LAMP或PCR檢測記錄、各凈化階段種雞的留種與淘汰記錄等（附錄D）。記錄保存2年。

（資料性附錄）

試劑的配制10mmol/LBetaine溶液Betaine1.1715g滅菌水10mL即配置成1mol/L濃度，取10μL加DEPC水至1mL，制成10mmol/LBetaine溶液。100mmol/LMgSO4MgSO4.7H2O0.246g滅菌水1L

（資料性附錄）

血清平板凝集試驗判定標準血清平板凝集試驗結果判定標準圖見圖B.1。血清平板凝集試驗結果判定標準對照圖（左為陽性，中為可疑，右為陰性）

（資料性附錄）

LAMP反應結果判定可見光下LAMP反應結果判定可見光下LAMP反應陽性（綠色熒光）與陰性（橙黃色）對照圖紫外光下LAMP反應結果紫外光下LAMP反應陽性（綠色熒光）與陰性（無熒光）對照圖

（資料性附錄）

雞毒支原體病和滑液囊支原體病凈化評估標準凈化標準評估同時滿足以下要求，視為達到凈化標準：種雞群抽檢，雞毒支原體和滑液囊支原體病原學檢測均為陰性；連續(xù)兩年以上無臨床病例；種雞群抽檢，曾祖代、祖代雞毒支原體和滑液囊支原體血清學抗體檢測陽性率為0，父母代雞毒