生物技術(shù)的免疫原性和免疫毒性課件

生物技術(shù)藥物生物技術(shù)藥物包括體內(nèi)診斷、治療與預(yù)防用途；來源于細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)、多肽及其衍生物、核酸如細(xì)胞因子、生長因子、融合蛋白、酶、激素、單抗、載體等特殊性結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)工藝、保存條件、同源性、作用靶點(diǎn)明確等固有的特點(diǎn)免疫毒性/免疫原性免疫毒性是指受試品引起免疫抑制或增強(qiáng)、過敏反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，可能與藥理活性相關(guān)（如抗排斥藥物）或不相關(guān)（如部分抗腫瘤藥物）。免疫原性指藥物刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。研究意義意義重大：如免疫抑制，感染↑，腫瘤↑免疫增強(qiáng)，放大自身免疫反應(yīng)或過敏反應(yīng)。免疫原性，是藥物本身具有的性質(zhì)，有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對(duì)藥物毒性、毒代或藥效的客觀評(píng)價(jià)。但在規(guī)范及指導(dǎo)原則方面，缺乏共識(shí)，實(shí)驗(yàn)方法也不統(tǒng)一免疫毒性研究內(nèi)容一常規(guī)的免疫毒性指標(biāo)包括：

白細(xì)胞總數(shù)及其分類計(jì)數(shù)球蛋白和白/球比值補(bǔ)體水平淋巴器官/組織的大體解剖胸腺和脾臟的器官重量免疫病理：胸腺、脾臟、引流淋巴組織免疫毒性研究內(nèi)容二額外的免疫毒性試驗(yàn)（additionalstudies），如

(1)常規(guī)免疫毒性檢測結(jié)果提示免疫毒性，感染↑

(2)受試品的結(jié)構(gòu)，與已知免疫調(diào)節(jié)劑相似

(3)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果:原型藥或代謝產(chǎn)物在免疫組織蓄積

(4)適應(yīng)癥:如用于抗HIV藥物

(5)藥理作用：常對(duì)免疫系統(tǒng)有影響常規(guī)的免疫毒性檢測結(jié)果

—引流淋巴組織檢查圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV假病毒后回腸粘膜下集合淋巴小結(jié)ＡＢＡ：對(duì)照組，Ｂ：高劑量組常規(guī)的免疫毒性檢測

—免疫抑制/增強(qiáng)全血細(xì)胞變化、白細(xì)胞變化或淋巴細(xì)胞變化等。免疫器官重量改變或組織學(xué)檢查顯示相關(guān)器官或組織細(xì)胞密度變化血清免疫球蛋白變化用藥組感染發(fā)生率升高用藥組腫瘤發(fā)生率增多(除遺傳毒性、激素效應(yīng)或肝酶誘導(dǎo)外)宿主因素、免疫方式蓄積數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對(duì)數(shù)后達(dá)正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示引起這些變化的劑量與產(chǎn)生其他毒性的劑量關(guān)系免疫原性(immunogenicity)PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）—陰性對(duì)照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取(5)藥理作用：常對(duì)免疫系統(tǒng)有影響hostresistance熒光標(biāo)記的膠珠觀察phagocytosis等Ａ：對(duì)照組，Ｂ：高劑量組可能繼發(fā)于其他因素(e.Ⅰ期臨床試驗(yàn)方案的教訓(xùn)：僅10min間隔hostresistance受體或藥靶介導(dǎo)的間接毒性反應(yīng)TSuppressor-cytotoxiccells靶分子在免疫器官或組織的分布生物技術(shù)藥物免疫原性評(píng)價(jià)PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）額外的免疫毒性試驗(yàn)內(nèi)容

免疫功能檢測如T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)、NK細(xì)胞活性、CTL活性、細(xì)胞因子表達(dá)、巨噬細(xì)胞/中性粒細(xì)胞功能、皮膚超敏反應(yīng)、宿主抵抗力研究）免疫表型檢測依據(jù)免疫學(xué)理論和具體靶分子種類額外的免疫毒性試驗(yàn)方案增設(shè)衛(wèi)星組、增加免疫學(xué)指標(biāo)或改變給藥方案等。發(fā)育免疫毒性：在成年動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)免疫抑制作用后，需要評(píng)價(jià)發(fā)育免疫毒性作用，如觀察母代暴露于藥物后仔代的淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、細(xì)胞因子等，兩種以上功能檢測等。不僅是免疫抑制！常規(guī)階梯或分層或標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合不一定合理，需個(gè)體化額外的免疫毒性試驗(yàn)方法

免疫功能檢測

Macrophage/Neutrophil熒光標(biāo)記的膠珠觀察phagocytosis等NK反映天然免疫功能TDARSRBCor鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH），用ELISA等CTL51Cr釋放法，ELISPOT法CytokinesELISA法及胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測額外的免疫毒性試驗(yàn)方法免疫功能檢測hypersensitivity目前預(yù)測IV型變態(tài)反應(yīng)

Buehler試驗(yàn)、豚鼠最大化試驗(yàn)（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗(yàn)、小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)autoimmunity

PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）hostresistance抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時(shí)）注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72%額外的免疫毒性試驗(yàn)方法免疫表型檢測常用流式細(xì)胞儀檢測，檢測表達(dá)水平和比例

SurfacemarkersIg+PanBcellsThy1.2+orCD3+PanTcells、CD4+CD8-THelper/delayed-typehypersensitivitycellsCD8+CD4-TSuppressor-cytotoxiccellsCD8+CD4+ImmatureTcells免疫功能檢測

—分泌IFNγ細(xì)胞圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV假病毒后外周血p24特異性的分泌IFN－γ的淋巴細(xì)胞數(shù)量免疫細(xì)胞表型檢測

—CD22陽性比例圖食蟹猴靜脈注射SM03嵌合抗體后CD22標(biāo)記陽性細(xì)胞率的變化

CD22陽性細(xì)胞比例（%）免疫細(xì)胞表型檢測

—CD4/CD8比例CD4/CD8比例圖獼猴iv4周LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例免疫毒性試驗(yàn)結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物學(xué)意義（尤其單一指標(biāo)）變化程度與劑量/暴露關(guān)系與擬用臨床劑量的關(guān)系療程關(guān)系涉及動(dòng)物種屬數(shù)量和受影響的終點(diǎn)可能繼發(fā)于其他因素(e.g.,stress,）可能的細(xì)胞靶點(diǎn)和（或）作用機(jī)制引起這些變化的劑量與產(chǎn)生其他毒性的劑量關(guān)系可逆性免疫毒性靶器官的分析線索靶分子在免疫器官或組織的分布受試品或其代謝產(chǎn)物的分布相關(guān)指標(biāo)的變化

—常規(guī)免疫指標(biāo)、細(xì)胞因子變化等。免疫毒性機(jī)制推測受體或藥靶直接引起的毒性反應(yīng)（on-target)—如干擾素引起骨髓抑制受體或藥靶介導(dǎo)的間接毒性反應(yīng)

—如rhIL-12能誘導(dǎo)干擾素的分泌非特異機(jī)制

—如rhTNK-tPA引起肝細(xì)胞劑量依賴性的脂肪變性。CD28激動(dòng)劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗(yàn)事件抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化、抗體的中和活性、。圖注射表達(dá)EPO基因裸質(zhì)粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測抗體產(chǎn)生對(duì)毒性反應(yīng)的影響Safetyevaluationofrecombinantstaphylokinase.hostresistance抗體與藥代/藥效和安全關(guān)系的評(píng)價(jià)免疫原性(immunogenicity)PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）目前預(yù)測IV型變態(tài)反應(yīng)(3)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果:原型藥或代謝產(chǎn)物在免疫組織—陰性對(duì)照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取免疫原性，是藥物本身具有的性質(zhì)，有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對(duì)藥物毒性、毒代或藥效的客觀評(píng)價(jià)。PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）免疫原性，是藥物本身具有的性質(zhì)，有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對(duì)藥物毒性、毒代或藥效的客觀評(píng)價(jià)?！`敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出蓄積免疫細(xì)胞表型檢測

—CD22陽性比例可能繼發(fā)于其他因素(e.免疫原性研究內(nèi)容免疫原性(immunogenicity)

指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen）。產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞能力。影響因素

分子大小，10000，5000～10000，1000～5000

分子結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)＞多糖＞核酸＞類脂宿主因素、免疫方式免疫原性研究意義免疫原性影響重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布（neutralizedrugactivityandalterdrugclearance,plasmahalf-life,andtissuedistribution）建立免疫分析方法，供臨床試驗(yàn)應(yīng)用免疫原性研究內(nèi)容抗體檢測方法學(xué)驗(yàn)證免疫反應(yīng)檢測抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化、抗體的中和活性、?？贵w與藥代/藥效和安全關(guān)系的評(píng)價(jià)同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應(yīng)的變化、補(bǔ)體激活與否、免疫復(fù)合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等抗體檢測方法ELISA-橋法包被藥物，用標(biāo)記的藥物檢測。ELISA-直接法包被藥物，用標(biāo)記抗體檢測。

（缺點(diǎn)：包被時(shí)可能會(huì)掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌時(shí)丟失低親和力抗體，參考品與樣本之間試劑可能不同）抗體檢測方法間接法包被單抗或生物素，再加藥物。放射免疫沉淀法（RIP）液相法，中等或高通量水平表面等離子體共振液相法，不需結(jié)合物（酶標(biāo)記抗體），能檢測到不同親和力的抗體和各亞型抗體電化學(xué)發(fā)光法液相法，可檢測各種抗體亞型抗體檢測方法考察方法學(xué)考察

—靈敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出

—受試物干擾：如有文獻(xiàn)報(bào)道，如血清中受試物濃度大于0.15μg/ml，則難以檢測到抗受試物抗體。一般從1：10開始稀釋或?qū)悠愤M(jìn)行處理。長效?

—精確度：利用陽性對(duì)照品重復(fù)測量

—陰性對(duì)照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取免疫復(fù)合物在肝腎的沉積Ａ：溶劑對(duì)照組猴腎組織Ｂ：重組葡激酶大劑量組腎組織ＡＢ圖獼猴iv重組葡激酶４周后腎組織的免疫組織化學(xué)染色抗體檢測結(jié)果描述抗體滴度結(jié)果表示數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對(duì)數(shù)后達(dá)正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示抗體檢測結(jié)果抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化抗體中和活性檢測常用依賴細(xì)胞株抗病毒致細(xì)胞病變（CPE）克隆細(xì)胞株靶基因檢測等。游離或與抗體結(jié)合的受試品對(duì)中和活檢測的干擾（偶聯(lián)抗體的瓊脂糖凝膠珠吸附）抗體中和活性的檢測

—CPE法圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV假病毒后血清對(duì)HIV-1HN024的中和活性—受試物干擾：如有文獻(xiàn)報(bào)道，如血清中受試物濃度大于0.hypersensitivity—如干擾素引起骨髓抑制免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評(píng)價(jià)和分析的重要性（ToxicolinVitr）?！鐁hIL-12能誘導(dǎo)干擾素的分泌液相法，可檢測各種抗體亞型常規(guī)階梯或分層或標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合不一定合理，需個(gè)體化中國新藥雜志,2007,16(3):181-188來源于細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞—陰性對(duì)照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取胸腺和脾臟的器官重量抗體與藥代/藥效和安全關(guān)系的評(píng)價(jià)autoimmunity抗體產(chǎn)生對(duì)藥效相關(guān)指標(biāo)的影響CD28激動(dòng)劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗(yàn)事件免疫器官重量改變或組織學(xué)檢查顯示相關(guān)器官或組織細(xì)胞密度變化hostresistanceＡ：對(duì)照組，Ｂ：高劑量組(2)受試品的結(jié)構(gòu)，與已知免疫調(diào)節(jié)劑相似—陰性對(duì)照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取抗體與藥代/藥效和安全關(guān)系的評(píng)價(jià)(5)藥理作用：常對(duì)免疫系統(tǒng)有影響免疫原性影響重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布抗體中和活性檢測方法

—靶基因表達(dá)受試品或其代謝產(chǎn)物的分布CD28激動(dòng)劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗(yàn)事件Safetyevaluationofrecombinantstaphylokinase.GuidelineonComparabilityofMedicinalProductsContainingBiotechnology-derivedProteinsasActiveSubstance:NonclinicalandClinicalIssues靶分子在免疫器官或組織的分布產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞能力。hypersensitivity15μg/ml，則難以檢測到抗受試物抗體。中國新藥雜志,2007,16(3):181-188免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評(píng)價(jià)和分析的重要性（ToxicolinVitr）。(2)受試品的結(jié)構(gòu)，與已知免疫調(diào)節(jié)劑相似猴并非一定是相關(guān)動(dòng)物，動(dòng)物記憶T細(xì)胞少。指藥物刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。蓄積液相法，中等或高通量水平免疫抑制，感染↑，腫瘤↑(1)常規(guī)免疫毒性檢測結(jié)果提示免疫毒性，感染↑抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時(shí)）抗體中和活性檢測方法

—靶基因表達(dá)抗體產(chǎn)生對(duì)藥效相關(guān)指標(biāo)的影響圖注射表達(dá)EPO基因裸質(zhì)粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測抗體產(chǎn)生對(duì)藥代的影響臨床上連續(xù)應(yīng)用重組水蛭素5ｄ以上可使74%的患者產(chǎn)生抗水蛭素抗體（AHAb）?？贵w產(chǎn)生對(duì)藥代的影響0481317210.010.1110TPO(ng/mL）-)時(shí)間(天)圖猴皮下連續(xù)注射rhTPO2g.kg-1.d-120d后血清rhTPO濃度(實(shí)測值和抗體滴度(,血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)）抗體產(chǎn)生對(duì)毒性反應(yīng)的影響圖食蟹猴sc2周和4周PEG-IFN后白細(xì)胞計(jì)數(shù)、抗體滴度和血清中和活性*****************中和抗體產(chǎn)生對(duì)給藥方案的意義中和抗體影響了大多數(shù)動(dòng)物的藥理和（或）毒性反應(yīng)，則可以考慮終止給藥。中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達(dá)到的血藥濃度的作用時(shí)，可以考慮終止給藥。需結(jié)合藥動(dòng)學(xué)資料?？偨Y(jié)生物技術(shù)藥物免疫毒性評(píng)價(jià)

—重視，個(gè)體化原則，采用新方法生物技術(shù)藥物免疫原性評(píng)價(jià)

—強(qiáng)調(diào)規(guī)范，分析與毒性反應(yīng)等關(guān)系CD28激動(dòng)劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗(yàn)事件德國公司研制的抗CD28超級(jí)激動(dòng)劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗(yàn)中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)（多器官衰竭）。CD28激動(dòng)劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗(yàn)事件研究發(fā)現(xiàn)注射受試品后很快導(dǎo)致前炎癥因子釋放（細(xì)胞因子風(fēng)暴），心肺功能衰竭。猴長毒：CD4+和CD8+T細(xì)胞一過性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但沒有出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征。CD28激動(dòng)劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗(yàn)事件的教訓(xùn)Ⅰ期臨床試驗(yàn)方案的教訓(xùn)：僅10min間隔免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評(píng)價(jià)和分析的重要性（ToxicolinVitr）。猴并非一定是相關(guān)動(dòng)物，動(dòng)物記憶T細(xì)胞少。主要參考文獻(xiàn)EMEA.GuidelineonComparabilityofMedicinalProductsContainingBiotechnology-derivedProteinsasActiveSubstance:NonclinicalandClinicalIssuesICH.

preclinicalsafetyevaluationof

biotechnology-derivedpharmaceuticals

s6ICH.immunotoxicitystudiesforhumanpharmaceuticalss8FDA.ImmunotoxicologyEvaluationofInvestigationalNewDrugs呂秋軍等.生物技術(shù)藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展。中國新藥雜志，2001，10（4）：252-256LuQiujun,etal.Safetyevaluationofrecombinantstaphylokinase.ToxicologicPathology,2003，31（1）：14-21呂秋軍.生物技術(shù)藥物免疫原性的評(píng)價(jià)及面臨的挑戰(zhàn).中國新藥雜志,2007,16(3):181-188謝謝！免疫毒性/免疫原性免疫毒性是指受試品引起免疫抑制或增強(qiáng)、過敏反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，可能與藥理活性相關(guān)（如抗排斥藥物）或不相關(guān)（如部分抗腫瘤藥物）。免疫原性指藥物刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。研究意義意義重大：如免疫抑制，感染↑，腫瘤↑免疫增強(qiáng)，放大自身免疫反應(yīng)或過敏反應(yīng)。免疫原性，是藥物本身具有的性質(zhì)，有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對(duì)藥物毒性、毒代或藥效的客觀評(píng)價(jià)。但在規(guī)范及指導(dǎo)原則方面，缺乏共識(shí)，實(shí)驗(yàn)方法也不統(tǒng)一額外的免疫毒性試驗(yàn)方法免疫功能檢測hypersensitivity目前預(yù)測IV型變態(tài)反應(yīng)

Buehler試驗(yàn)、豚鼠最大化試驗(yàn)（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗(yàn)、小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)autoimmunity

PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）hostresistance抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時(shí)）注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72%圖獼猴iv4周LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物學(xué)意義（尤其單一指標(biāo)）抗體產(chǎn)生對(duì)藥效相關(guān)指標(biāo)的影響圖猴皮下連續(xù)注射rhTPO2g.LuQiujun,etal.抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化靶分子在免疫器官或組織的分布PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）抗體中和活性檢測方法

—靶基因表達(dá)生物技術(shù)藥物免疫原性的評(píng)價(jià)及面臨的挑戰(zhàn).可能繼發(fā)于其他因素(e.免疫器官重量改變或組織學(xué)檢查顯示相關(guān)器官或組織細(xì)胞密度變化免疫器官重量改變或組織學(xué)檢查顯示相關(guān)器官或組織細(xì)胞密度變化(5)藥理作用：常對(duì)免疫系統(tǒng)有影響額外的免疫毒性試驗(yàn)方法hostresistance抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化、抗體的中和活性、。中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達(dá)到的血藥濃度的作用時(shí)，可以考慮終止給藥。中國新藥雜志，2001，10（4）：252-256目前預(yù)測IV型變態(tài)反應(yīng)免疫增強(qiáng)，放大自身免疫反應(yīng)或過敏反應(yīng)。免疫原性研究內(nèi)容抗體檢測方法學(xué)驗(yàn)證免疫反應(yīng)檢測抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化、抗體的中和活性、?？贵w與藥代/藥效和安全關(guān)系的評(píng)價(jià)同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應(yīng)的變化、補(bǔ)體激活與否、免疫復(fù)合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等抗體檢測結(jié)果描述抗體滴度結(jié)果表示數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對(duì)數(shù)后達(dá)正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示抗體檢測結(jié)果抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化抗體中和活性的檢測

—CPE