第十三次課單克隆抗體從診斷到治療詳解演示文稿

第十三次課單克隆抗體從診斷到治療詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)（優(yōu)選）第十三次課單克隆抗體從診斷到治療目前二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)“thespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystem”andthethediscoveryof“theprincipleforproductionofmonoclonalantibodies”目前三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)Natural-SelectionTheoryofantibodyformation（抗體形成過(guò)程中的自然選擇學(xué)說(shuō)）1955年SomaticGenerationofimmuneRecognition（免疫系統(tǒng)的自我建立學(xué)說(shuō)）1971年

NetworkTheory（免疫系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)）1974年目前四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)免疫相關(guān)疾病和生物學(xué)過(guò)程自身免疫疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡器官移植：免疫排斥過(guò)敏：有機(jī)體對(duì)某些藥物或外界刺激的感受性不正常地增高的現(xiàn)象；過(guò)分敏感疫苗：基因重組乙肝疫苗目前五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)Tcell在胸腺中經(jīng)歷陽(yáng)性和陰性篩選過(guò)程目前六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)目前七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)1、多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）：

用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物。

2、單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：

由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無(wú)交叉反應(yīng)性。與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。目前八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)McAbandPcAb目前九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)雜交瘤技術(shù)的誕生

1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國(guó)《自然》雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）1984年度榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)目前十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)

一、雜交瘤技術(shù)的基本原理

聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合

HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤

細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體目前十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)抗體種類：第一代抗體多克隆抗體

（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)目前十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)，單

隆抗體目前十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)流程目前十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)

不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈

HGPRT-（次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）;TK-（胸腺嘧啶核苷激酶）

與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái)源于LOU/c大鼠建立的骨髓瘤細(xì)胞系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653NSO/1目前十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)

動(dòng)物：BALB/c小鼠4～8周齡20g～25g體重（二）免疫脾細(xì)胞目前十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫體內(nèi)免疫法--免疫原性強(qiáng)、來(lái)源充分的抗原，對(duì)于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了免疫小鼠目前十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)。淋巴細(xì)胞目前十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)。漿細(xì)胞目前十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)。抗原接種目前二十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)免疫原特性抗原量接種次數(shù)間隔時(shí)間單抗的特性抗體滴度親和性免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等）106-107個(gè)細(xì)胞或1-10ug2-42-4周高中等至強(qiáng)免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或強(qiáng)免疫原性弱A.20-400ug2-4隨后2-3每月2-3月中等強(qiáng)B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加強(qiáng)每月10天1-2月中等中等或強(qiáng)表6-1不同免疫抗原的免疫程序（引自劉秀梵，1994）

目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細(xì)胞融合目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同最早仙臺(tái)病毒被用做融合劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問(wèn)題目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG（8－氮鳥(niǎo)嘌呤）處理細(xì)胞，以維持HGPRT-的狀態(tài)。注意事項(xiàng)：切忌過(guò)多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。同時(shí)通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘通常每只小鼠1×108-2.5×108個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細(xì)胞。免疫脾細(xì)胞的制備：1×108的淋巴細(xì)胞無(wú)菌手術(shù)目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞其中巨噬細(xì)胞還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過(guò)2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化

在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercells）。飼養(yǎng)細(xì)胞：目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)。飼養(yǎng)細(xì)胞目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)融合方法a、將1×108脾細(xì)胞與2×107-5×107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。b、1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。c、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻;置40℃水浴中預(yù)熱。d、用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時(shí)間為45秒）加預(yù)熱至40℃的50%PEG（PH8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。e、用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至37℃的不完全培養(yǎng)基；20-37℃靜置10分鐘。f、1000r/min5分鐘；棄去上清。g、加入5mlHAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80-100ml。h、分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔；分裝24孔板，每孔；然后將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。i、5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。j、7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。l、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清供抗體檢測(cè)。目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來(lái)，通常也稱為抗體檢測(cè)。融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)常用的抗體檢測(cè)方法：（1）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性高，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。用可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用全菌抗原的ELISA用全細(xì)胞抗原的ELISA抗體捕捉ELISA試驗(yàn)ABC-ELISA試驗(yàn)Dot-ELISA試驗(yàn)免疫組化染色法（2）免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光法活細(xì)胞的膜熒光染色（3）間接血凝試驗(yàn)（4）放射免疫測(cè)定目前三十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-氮鳥(niǎo)嘌呤目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑（D途徑）

T（Thymidine）：胸腺嘧啶核苷酸；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNA。H和T聯(lián)合阻斷DNA合成的替代途徑。目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)HAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡。DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡。HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑被阻斷目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)SP2/O:HGPRT-，TK-;長(zhǎng)命脾細(xì)胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長(zhǎng)命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)有限稀釋法(limitingdilution)

FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞有限稀釋法每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個(gè)稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)效率最高價(jià)格昂貴FACS（

FluorescenceActivatingCellSorter）目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)軟瓊脂平板法(softagarmethod)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天克隆生長(zhǎng)至2mm時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。吸取上清，檢測(cè)抗體，陽(yáng)性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。目前四十頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

保存數(shù)年至數(shù)十年“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇在建立雜交瘤細(xì)胞的過(guò)程中，有時(shí)一次融合產(chǎn)生很多“陽(yáng)性”孔，來(lái)不及對(duì)所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來(lái)；另一方面，為了防止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡細(xì)胞冷凍的意義目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)（1）單克隆性的確定

包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。A、雜交瘤細(xì)胞的染色體分析對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細(xì)胞的客觀指標(biāo)之一，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40，小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為62-68，NS-1為54-56；

B、單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定

免疫擴(kuò)散ELISAC、單抗純度的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、等電點(diǎn)聚焦電泳（IEF）及免疫

轉(zhuǎn)印分析（WB）等方法都可用于鑒定單抗的純度。PAGE、SDS、IEF、WB（三）單克隆抗體的性質(zhì)鑒定目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)（2）單抗理化特性的鑒定抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的程度，其高低主要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構(gòu)型的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（K）表示。常用的方法有競(jìng)爭(zhēng)ELISA、非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 、間接ELISA、間接法夾心ELISA等（3）單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性測(cè)定包括各類免疫血清學(xué)試驗(yàn)、生物學(xué)試驗(yàn)和免疫化學(xué)技術(shù)等目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)

三、單克隆抗體的制備

經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十三頁(yè)\編于十點(diǎn)（一）單克隆抗體的產(chǎn)生1動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只,

使用的動(dòng)物當(dāng)然首選BALB/c小鼠,將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高?？梢?jiàn)該法操作