中藥指紋圖譜4

中藥指紋圖譜研究概況湖北中醫(yī)學院藥學院干國平博士2009.11引言

中藥指紋圖譜技術是當今國際公認的控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控模式，其研究的方法和技術日趨成熟完善，是目前控制中藥和天然藥質(zhì)量最有效的方法和手段之一。

中藥指紋圖譜能從原藥材的栽培、引種，中成藥生產(chǎn)工藝的規(guī)范與優(yōu)化，到產(chǎn)品質(zhì)量標準的制定提供全方位的質(zhì)量保證。引言日本漢方藥在20世紀80年代就采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。歐共體也將指紋圖譜監(jiān)控技術應用于植物藥質(zhì)量控制。美國食品藥品管理局允許草藥保健品申報資料時提供色譜指紋圖。世界衛(wèi)生組織在1996年草藥評價指導原則中也規(guī)定：如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

1.我國研究中藥指紋圖譜的歷史

20世紀70年代：我國的學者嘗試用UV、IR、TLC、GC進行中藥的鑒別研究；

1.我國研究中藥指紋圖譜的歷史

20世紀80年代~90年代：《中國藥典》1995年版一部收載了TLC法鑒別中藥材及中成藥?！吨袊幍洹?000年版一部中藥薄層色譜鑒別引進了“對照藥材”，以完整的色譜圖像作為鑒別的依據(jù)而正式納入國家藥品標準?！吨袊幍洹?005年版一部HPLC、GC廣泛用于中藥的定性、定量分析

1.我國研究中藥指紋圖譜的歷史痔瘡栓中黃柏的TLC鑒別1.陰性對照2.樣品3.黃柏對照藥材

逍遙丸中甘草的鑒別（1.陰性對照、2.樣品3.對照藥材）

123甘草的來源：甘草GlycyrrhizauralensisFisch.脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖1.中藥指紋圖譜的歷史2000年:

國家藥監(jiān)局頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》。國家從行政管理的角度，正式要求已注冊的中藥注射劑須進行指紋圖譜研究和納入質(zhì)量標準；規(guī)范了中藥指紋圖譜的研究，從而促進了國內(nèi)近幾年來對指紋圖譜的研究熱潮。2.中藥指紋圖譜的定義定義：

運用現(xiàn)代分析技術對中藥化學信息以圖形（圖像）的方式進行表征并加以描述?，F(xiàn)代分析技術：TLC、TLCS、HPLC、HPLC-MS、GC、GC-MS、HPCE、IR、NMR、X-射線衍射、DNA指紋圖譜等。主要是色譜技術。2.中藥指紋圖譜的定義表征和描述：“表征”是將中藥化學信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖）等方式進行表達；“描述”是對指紋圖譜經(jīng)過計算、分析、比較、評價等過程，以技術參數(shù)、指紋特征等加以說明。分析比較的結(jié)果，是對供試品與對照品之間的差異或一致性作出評價。3.建立中藥指紋圖譜的目的和意義中藥的特點：（1）中藥化學成分的多樣性與復雜性；（2）中藥藥效成分的非單一性；（3）中藥質(zhì)量的不穩(wěn)定性。

3.建立中藥指紋圖譜的目的和意義

（1）對中藥質(zhì)量控制的補充和提高：現(xiàn)有質(zhì)量控制模式：以1個或1個以上成分為控制指標，難以準確、全面地評價中藥質(zhì)量。指紋圖譜從整體上評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量，已為國際社會所認可，有利于中藥及產(chǎn)品進入國際市場。3.中藥指紋圖譜的研究目的意義

（2）提高中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性

控制原料、中間體、成品的一致性，減少批間差異，提高中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性。

（1）系統(tǒng)性：盡可能多的覆蓋全貌。指紋圖譜反映的化學成分應包括中藥有效所部位所含大部分成份的種類，或指標成分的全部。4.中藥指紋圖譜建立的原則

（2）特征性：特征明顯，專屬性強。指紋圖譜中反映的化學成分信息應具有高度的選擇性，這些信息的綜合結(jié)果，將能特征地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的化學條碼。4.中藥指紋圖譜建立的原則

（3）重現(xiàn)性：重現(xiàn)性好。重現(xiàn)性是保證指紋圖譜的使用具有通用性和實用性的前提。4.中藥指紋圖譜建立的原則菝葜抗腫瘤活性部位指紋圖譜的研究1.藥材來源2.色譜條件3.供試品和對照品溶液的制備4.方法學考察5.指紋圖譜及技術參數(shù)1.藥材來源（10種菝葜、4種近緣品種）樣品編號藥材產(chǎn)地來源1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.2湖南靖州菝葜S.chinaL.3安徽墳天山菝葜S.chinaL.4廣西賓陽菝葜S.chinaL.5廣東省從化縣菝葜S.chinaL.6重慶市馬腳山菝葜S.chinaL.7浙江溫州市永嘉縣上塘鎮(zhèn)菝葜S.chinaL.8福建仙游菝葜S.chinaL.9湖南岳陽菝葜S.chinaL.10江西樟樹市讓山菝葜S.chinaL.

11江西弋陽小果菝葜（S.davidianaA.DC）12湖南長沙長托菝葜（S.feroxWall.exKunth）13湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)14湖北咸寧土茯苓(S.glabraRoxb.)2.色譜條件：

KromasilC18柱（4.6×250mm，5μm）流速:0.8ml·min-1進樣量:20μL；檢測波長:330mm；流動相:乙腈-甲醇-0.04％磷酸溶液

梯度洗脫程序（V/V,%）

時間（min）乙腈甲醇0.04％磷酸溶液010387301238532173806018379100283693.供試品溶液的制備

樣品粉末70％乙醇超聲提取濾過，取續(xù)濾液蒸干殘渣熱水溶解乙酸乙酯萃取乙酸乙酯液甲醇定容微孔濾膜濾過蒸干殘渣供試品溶液4.對照品溶液的制備

精密稱取黃杞苷對照品適量，加甲醇制成每ml含50μg的溶液。

5.1精密度試祖驗5.2寫穩(wěn)定性賄試驗5.3重姨現(xiàn)性試驗5.方法學考慘察精密度和燥穩(wěn)定性試蜓驗結(jié)果（相對保地留時間）(n禿=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2730.2730.2750.2740.4920.3940.3960.3960.3930.3960.3950.3630.4880.490.4910.4860.490.4890.4140.8010.8040.8030.80.8020.8020.2050.8520.8550.8550.8520.8530.8530.1860.9200.920.9180.9190.9210.9200.127（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2651.2551.2681.2711.2660.5091.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7081.6961.7071.7011.7050.35111.7771.7831.7861.7821.7781.7810.21121.8251.8311.8351.8291.8251.8290.23精密度和篩穩(wěn)定性試房誠驗結(jié)果（相對峰面胡積）(n廊=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD（％）10.7500.7570.7750.7730.7840.7681.8120.1770.1760.1690.1750.1760.1751.8430.3590.3590.3620.3590.3600.3600.3640.2310.2330.2200.2250.2340.2292.6050.2280.2210.2210.2240.2260.2241.3861.4531.4611.4321.4621.4881.4591.387（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8567.8407.8417.8407.8480.1390.2540.2570.2540.2550.2530.2550.60101.2701.2741.2721.2741.2741.2730.14110.2980.2910.2900.2940.2960.2941.14120.5780.5780.5740.5780.5770.5770.30精密度與關穩(wěn)定性試濤驗結(jié)果：☆各共箱有峰相對證保留時間廊和相對峰盆面積的R辜SD均小來于3％;☆儀浙器的精準密度良貼好；☆供菠試品溶材液在1裳2h內(nèi)服基本穩(wěn)倦定；重現(xiàn)性襖試驗結(jié)蛾果（相對保留紡時間）(n槍=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2750.2730.2780.2750.6620.3940.3960.3960.3960.3940.3950.2830.4880.490.490.4910.4890.4900.2340.8010.8030.8020.8030.8030.8020.1150.8520.8550.8550.8530.8520.8530.1860.920.9190.920.9210.920.9200.087（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2641.2651.2651.2651.2660.1591.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7061.7061.7061.7061.7070.13111.7771.7821.7781.7811.7821.7800.13121.8251.831.831.8311.8311.8290.14重現(xiàn)性試造驗結(jié)果（相對峰袍面積）(n=堅5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.750.7590.760.7630.7740.7611.1420.1770.1750.1790.1770.1770.1770.8030.3590.360.3590.3620.3590.3600.3640.2310.2230.220.2240.2240.2241.8050.2280.2240.2210.2270.220.2241.5861.4531.4611.4571.4591.4621.4580.257(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8557.867.8497.8457.8540.0990.2540.2540.2560.2550.2530.2540.45101.271.2741.2721.2741.2731.2730.13110.2980.2930.290.2890.2970.2931.38120.5780.5750.5790.5780.5780.5780.26重現(xiàn)性悼試驗結(jié)壟果：☆各共有峰燦相對保留換時間的R蜓SD均小世于3％；☆各耀共有峰賴相對峰餃面積的餓RSD伯均小于度3％；☆表盒明方法尼的重現(xiàn)學性好。6.指紋圖譜童及技術參卡數(shù)6.1指無紋圖譜的牛制備6.2共軌有指紋峰通的標定6.3共輸有指紋峰阻面積的比嘗值6.4歌非共有彎峰面積譯的比值6.5憤主要指拼紋峰的受歸屬6.6聞相似度植分析6.1棋指紋圖譜銳的制備分別精密億吸取供試墳品溶液（10批菝座葜正品及愚4批菝葜初近源品種）各2貌0μL長，注入荒液相色有譜儀，某按上述恰色譜條聾件測定摘，記錄90mi茂n內(nèi)色譜詳圖10批正菝葜指字紋圖譜諸疊加圖6.2共有指網(wǎng)紋峰的遙標定以相對謊保留時貪間標定狼了12享個共有往峰S6.2共有指紋殺峰的標定(共有峰相傻對保留時同間)峰號樣品1234567(S)8910111210.2750.3940.4880.8010.8520.9201.0001.2691.3421.7111.7771.82520.2760.3980.4880.8000.8380.9191.0001.2721.3461.7081.7731.82030.2760.3950.4890.8040.8540.9241.0001.2761.3431.7101.7691.81640.2770.3940.490.8020.8520.9241.0001.2791.3451.7101.8061.82450.2750.3950.4890.8040.8530.9211.0001.2711.3381.6991.7671.81560.2760.3920.4710.7740.8560.9181.0001.2701.3411.6941.7681.79170.2740.3950.4850.8000.8520.9181.0001.2651.3321.6941.7681.79180.2770.3960.4890.7990.8500.9191.0001.2721.3401.7021.7691.81690.2730.3940.4850.8000.8490.9191.0001.2711.3421.7101.7741.805100.2760.3970.4900.8010.8380.9191.0001.2701.3381.7041.7681.817平均值0.2760.3950.4860.7990.8490.9201.0001.2721.3411.7041.7741.812RSD(％)0.460.021.331.051.380.99011.081.091.371.27符合指紋稠圖譜的要滿求6.3共有指紋西峰面積的醬比值（以參照峰夾S的峰面戲積為1計胳算）峰號樣品1234567(S)8910111210.7500.1770.3590.2310.2281.4531.0007.8620.2541.2700.2980.57821.1791.4270.5271.3921.0901.8091.0007.9341.0211.6681.0090.51430.7820.1310.1650.3000.0851.0891.0006.2900.2050.4820.1430.18541.1600.2431.0750.6301.8051.8011.0007.9110.2870.7890.9820.25250.1980.8150.2030.3800.7211.0441.0006.2950.2960.6030.3380.07061.3931.6601.2961.8320.5861.8121.0006.3170.2372.7041.0880.62371.2842.4331.7551.3242.0151.4771.0006.2990.9442.6810.7970.96781.0100.3361.8690.6611.6271.4571.0006.8670.5881.0330.5610.32290.8050.2761.6510.9340.4271.7911.0009.3810.5291.7770.2280.462102.5041.3192.6251.1501.9831.2161.0009.2850.8992.3311.0250.323峰面積占檢總峰面積榴大于20蜜％，其差僻值不大于工±20％峰面積著占總峰夢面積大國于10番％，而吹小于2格0％，畜其差值控不大于核±25喬％符合指紋震圖譜的要胡求6.4非共有峰伸峰面積的浪比值樣品編號非共有峰面積總峰面積比例（％）17722.52657452.91220932.811140381.8831099.9530092.0741575.31148171.3751458.8443423.2961338.21031741.2973580.51271932.8182254.71310091.7291309.6779991.68101171.1423102.77非共有接峰占總謹峰面積習的比值均小于5像％符合指方紋圖譜蠢的技術扮要求6.5共有峰悼的歸屬水飛薊賓13.林0mi頃n氧化白粱藜蘆醇43.6壤m(xù)in黃杞苷47.5消min白藜蘆醇60.0盜min6.6指紋圖犧譜的相怎似度樣品編號藥材產(chǎn)地來源相似度（％）1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.1002湖南靖州菝葜S.chinaL.99.53安徽墳天山菝葜S.chinaL.90.74廣西賓陽菝葜S.chinaL.91.35廣東省從化縣菝葜S.chinaL.89.06重慶市馬腳山菝葜S.chinaL.91.97溫州永嘉縣上塘鎮(zhèn)菝葜S.chinaL.94.08福建仙游菝葜S.chinaL.94.79湖南岳陽菝葜S.chinaL.91.810江西樟樹市讓山菝葜S.chinaL.

87.46.6指紋圖巾譜的相洋似度樣品編號藥材產(chǎn)地來源相似度(％))1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.10011江西弋陽小果菝葜（S.davidianaA.DC）71.512湖南長沙長托菝葜（S.feroxWall.exKunth）67.913湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)70.014湖北咸寧土茯苓(S.glabraRoxb.)65.14種近緣跪品種指紋刊圖譜的相葵似度均在釋75%以怪下菝葜與四斧種近緣品補種的指紋妨圖譜比較菝葜小果菝托葜長托菝鴿葜黑果菝葵葜土茯苓1.不同產(chǎn)地圣菝葜的指煮紋圖譜間爪有一定的餅差異，反膠映了菝葜羽藥材質(zhì)量對的不穩(wěn)定窗性。主要僻表現(xiàn)在：（1）紋品種相馳同、產(chǎn)嫂地不同獻的藥材焦化學成躬分基本巧相同，浩但含量麥相差較妹大；（2）菝痕葜與其近毫緣品種間虛的化學成滑分及含量薄均相差較居大2.正品螺和近緣動品種指丸紋圖譜罩的相似度差很異較大，方表明研究和凝制定菝逃葜藥材挪的指紋訴圖譜，栽對控制注其藥材賭質(zhì)量具監(jiān)有重要兔意義。討論6.中雙藥指紋懼圖譜發(fā)旨展的階壺段性中藥指紋申圖譜的發(fā)英展可分為趴：初級階段高級階崗段：6.中路藥指紋爹圖譜發(fā)某展的階燃段性（1）祖初級階過段確立指紋踐圖譜的建籮立方法及動相似度判頭定。中藥注駛射劑起婦效快，錘療效好它，化學阻成分相蒸對其他灑中藥來尸說要少蜘得多，牢但對其酬產(chǎn)品質(zhì)墳量要求拼又比其姓他中藥珠制劑更照高，選褲擇中藥農(nóng)注射劑券,開勝展制訂座其指紋愧圖譜工丘作具有懶很強的姑可行性幼。5.中泳藥指紋飼圖譜已減取得的響成果（1）咬中藥質(zhì)出量控制累和評價金模式的棟轉(zhuǎn)變：開始由委單一指織標成分扎的鑒別宵及含量滲測定為濾平臺向油以多組誰分相互憑依存的削化學分極布模式字的整體絹模式—鉗—“指概紋圖譜稍”模式僵為平臺誼的遞進顛，即由窩“點”栗向“面夫”遞進宅。5.中騙藥指紋贊圖譜已水取得的樸成果指紋圖重譜在一陽定程度雙上將中獨藥的化企學成分衰以色譜項整體為恩特征展?jié)姮F(xiàn)出來調(diào)，先構(gòu)俗建一個“灰色質(zhì)駁量信息庫消”，供我們墻逐步揭示眠其化學組陸成，以及范成分分布繭和相互比研例的關系胡，逐步減惜低其“灰病度”，提超高“透明剖度”，讓割我們看的押越來越清裁楚，減少尺客觀存在算的不確定肆性（模糊罩性），提世高穩(wěn)定性渠。力求從壘整體的視災角把現(xiàn)代碰科技研究擇的與質(zhì)量攏有關的數(shù)讀據(jù)和信息神與中醫(yī)藥炭傳統(tǒng)經(jīng)驗箏相結(jié)合。5.中勝藥指紋駕圖譜已部取得的和成果（2）中辰藥指紋圖滾譜實驗研發(fā)究技術逐丹漸成熟：中藥指紋征圖譜實驗勾研究技術嘴已有初步杏的規(guī)范化釀要求；指伸紋圖譜的薯實驗研究陡與市場產(chǎn)膜品的結(jié)合續(xù)進入了實掘用的初級瓶階段。5.中藥暴指紋圖譜憶已取得的蔥成果（3）抵化學計量摸學的滲透閉，迅速取執(zhí)得初步成版效，并開鉛發(fā)出相應型的計算機賴軟件：a.相缺似度評壤價法b.模型糊聚類卻分析法c.人工需神經(jīng)網(wǎng)絡豬法d.主成眠分分析法化學計量米學在指紋抱圖譜研究遙和應用中違的結(jié)合逐妹漸向縱深個發(fā)展，促辱進化學計索量學迫切斬地向“草肌根問題”緩實用研究墓發(fā)展。5.中效藥指紋村圖譜已彈取得的烘成果（4）飲74種舍注冊中罪藥注射艘劑指紋農(nóng)圖譜研托究結(jié)合吐生產(chǎn)實流際取得抬確鑿的壓成果：不少品種宏通過指紋刊圖譜的研但究，進一車步規(guī)范了撐生產(chǎn)工藝看、提高了腸產(chǎn)品質(zhì)量進，并通過繪了技術鑒默定，如獲繞批準為質(zhì)東量標準的樂內(nèi)容，將沉對規(guī)范和共監(jiān)管藥品醫(yī)的質(zhì)量穩(wěn)靈定和一致回起到肯定稼作用，對費普遍提升失中藥產(chǎn)品叔質(zhì)量起到份示范作用滲。5.中藥氧指紋圖譜郵已取得的攏成果（5）中指紋圖鞋譜技術痛得到全董國范圍歇的普及慶，有關設高等院悶校及科蓋研機構(gòu)睬普遍列處入科研牙選題，表論文數(shù)壞量飚升酸，促進荷了色譜太技術的料迅速提芽高。5.中藥頂指紋圖譜羊已取得的午成果（6）企長業(yè)對藥品銅質(zhì)量意識塔的提高：指紋圖譜機技術不僅暗已應用于桑中藥注射泊劑的質(zhì)量靜控制，而舌且也促使礦某些企業(yè)奸意識到藥興品市場由喜商業(yè)運作桶取勝必將貨逐漸轉(zhuǎn)向拉以內(nèi)在質(zhì)取量取勝，月由行政保薦護逐漸轉(zhuǎn)恐變?yōu)橐揽繗堊陨砑夹g兄提高保護凡，而開始憶自覺和主矛動地對自紐奉己的主要暫產(chǎn)品進行偉指紋圖譜祝研究。6.中章藥指紋掌圖譜發(fā)球展的階棚段性存在的浮問題：（1）犯指紋圖輝譜的研穿究集中沖在藥材夾，對復階方的研移究不多如何挖掘含復方中藥轉(zhuǎn)的質(zhì)量信析息需要更問多的研究疲。結(jié)合體微內(nèi)藥物代揚謝的研究析，更需要末細致地研園究中藥成晴分分布的坑整體特征臨以及在體按內(nèi)的整體奔表達。6.中藥饑指紋圖譜寬發(fā)展的階宵段性存在的問功題：（2）凍指紋圖專譜研究陡存在由女熱轉(zhuǎn)冷劑的傾向含：現(xiàn)階段握指紋圖沾譜的作懶用僅僅床停留在胳“相似案度”的青評價的骨層面上段。更有甚哥者，以隊目前已猜知的有麥限知識瀉過早地蘆取舍，辛淺嘗輒查止，急艷于追新贊求變，窯心態(tài)急勝躁。6.中藥犧指紋圖譜濃發(fā)展的階憂段性（2）炸高級階豪段在得到羊相對完陷備的中姓藥指紋擾圖譜后珠，應進敏入研究柔的高級計階段，河