放射醫(yī)學研究所課件

2004.06中式卷煙的生物醫(yī)學評價技術報告內容發(fā)展中式卷煙的意義

——從吸煙與健康談起中式卷煙的生物醫(yī)學評價技術

——技術原理與方法代表性中式卷煙的安全性評價舉例

——煙絲添加神農液降低卷煙危害——使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害

吸煙與健康

——事實與問題1965~1998年間美國大于18歲公民中吸煙者的比例（按性別）（CDC，MMWR,2000，Vol49,No.39）

事實1964USSurgeonGeneral報告吸煙對健康的不良影響196541%的美國成年人吸煙1967煙盒上標示“吸煙有害健康”1970電視上禁止煙草廣告2000美國只有25%的成年人吸煙1900~1998年間美國成年人年均吸煙量煙草中含有大量碳水化合物（占40%~50%），羧酸，色素，萜烯類，鏈烷烴，類脂物質，以及一些生長必需的營養(yǎng)物（如硝酸鹽等）和某些污染物（如農藥、重金屬等）吸煙是不完全燃燒過程，煙草經一系列熱分解與熱合成反應，產生大量化學物質。據分析，煙氣中化學成分共5068種，除煙草中存在的1172種外，3896種是吸煙過程中產生的新的化學物質——Roberts，1988TobaccoReporter事實卷煙煙氣的粒相物（如脂肪烴、芳香烴、萜類、羰基化合物、酚類、有機酸、氮雜環(huán)、亞硝胺、金屬）和氣相物（如氮、氧、CO2、CO、氫、揮發(fā)性烴類、酯類、呋喃類、腈類）中包含多種有害成分，如氣相中的CO、氮氧化物、丙烯醛、揮發(fā)性芳香烴、氫氰酸，粒相中的稠環(huán)芳烴、酚類、煙堿、亞硝胺、雜環(huán)化合物及微量放射性元素，以及氣相與粒相中都存在的自由基等Hoffmannlist：卷煙煙氣存在44種有害成分69種致癌物中（包括一些促癌劑或輔致癌物）NNK最受關注——HoffmannD：ChemResToxicol2001;14(7):767-9040年吸煙（40支/天）的累積NNK量可致癌——HoffmannD：PrevMed1997;26(4):427-34事實全世界每年死于與吸煙有關的疾病人數達400萬，相當于每8秒就有1人死亡。預計這一數字在2020年會上升到1000萬在中國，平均每天約有3000人死于吸煙——世界衛(wèi)生組織煙草與衛(wèi)生規(guī)劃署《煙草與衛(wèi)生：全球狀況報告》在美國，因吸煙引起的死亡，包括母親吸煙所致嬰兒早熟及被動吸煙等間接的影響在內，每年估計超過400000人，約為全部死亡數的1/5，由此花費的醫(yī)療和保健費用約1500億美元

美國每年死于與吸煙有關的疾病人數（430,000人）(引自：CDC,MMWR1999;48;131-38)

(1990~1994年間年平均值)事實1994年美國與吸煙有關的疾病死亡情況（引自：CDC，MMWR1997,Vol.48,No.43;993-996）疾病男性女性合并癌癥

肺癌81,17935,741116,920食道癌1,0551,9453,000其他癌癥21,6599,74331,402合計103,89347,429151,322心血管疾病

高血壓3,2332,1515,450心臟病88,64445,591134,235中風14,9788,30323,281其他心血管疾病11,6825,17216,854合計118,60361,117

179,820呼吸器官疾病

肺炎11,292

7,881

19,173支氣管炎/肺氣腫9,2345,541

14,865慢性阻塞性肺障礙30,38518,579

48,982其他呼吸疾病

787

6681,455合計

51,788

32,689

84,475嬰兒患病數1,006705

1,711火災死亡人數

863499

1,362總數

276,153142,537418,6901995年英國因吸煙的疾病死亡人數統計數據(引自：HealthEducationAuthority,1998)在英國，估計每年有28.4萬人因吸煙引起的疾病住院治療，其中死亡人數約12萬人。據估計，1950~2000年間，英國有600萬人死于與吸煙有關的疾病，平均每年死于吸煙的人數是二戰(zhàn)前的12倍。1995年，英國死于吸煙的人數為12.31萬人，是交通事故(3444人)、吸毒(2663)、犯罪謀殺(503)、自殺(4379)、愛滋病(195)以及其他意外死亡(8986)的總和（20170）的6倍疾病

死亡百分比死亡人數男性女性男性女性合并癌癥

肺癌907321,1009,50030,600咽喉癌74471,5004001,900食管癌71622,9001,6004,500膀胱癌48171,7003002,000腎癌415700100800胃癌35101,7003002,000胰癌21256008001,500其他癌癥3472,4005003,000白血病1910200100300合計

46,600心血管疾病

心臟病231118,7007,60026,400主動脈瘤62484,0001,8005,800心肌退化2410300300600動脈硬化癥175100100200中風1393,4003,9007,300合計

40,300其他疾病

支氣管炎和肺氣腫867915,1009,30024,400肺炎25115,8004,1009,900胃和十二指腸潰瘍4741100010001,900總計

81,30041,700123,100吸煙避免死亡

巴金森氏癥

9003001,200子宮肌瘤

100100合計

9004001,300總數

80,40041,300121,800吸煙者的“誤區(qū)”停止吸煙會導致體重增加沒有直接證據表明吸煙能導致癌癥肺癌是多因素疾病絕大多數人都吸煙吸煙的危害遠沒有政府宣傳和倡導的那么嚴重許多重度吸煙者并沒有得病，且壽命很長目前市場是的煙焦油量都較低，每天吸煙少于20支應該說是安全的環(huán)境煙草煙氣對不吸煙者并沒有嚴重的影響問題中式卷煙的生物醫(yī)學評價技術——技術原理與方法篩選對煙氣敏感的細胞系：用于實驗研究的細胞系有數百種，其中人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)富含P450酶，在無需代謝活化因子S9時能轉化利用NNK等煙氣中主要有害物質研制中的細胞氣體中毒裝置：細胞在培養(yǎng)液中染毒，與人類吸煙實際情況有差別，研制細胞氣體中毒裝置對煙氣評價意義重大卷煙煙氣毒理學評價動物吸煙中毒實驗模型建立：動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻條件下自由吸入卷煙煙氣動物吸煙試驗煙氣細胞中毒試驗急性毒性評價方案急性毒性慢性毒性蓄積毒性生殖毒性免疫毒性增殖死亡氧化損傷膜損傷致突致畸致癌基因毒性煙草煙氣中有數千種物質，單一或數種有害成分的分析難以全面真實客觀地反映吸煙的健康影響。卷煙煙氣毒理學評價是以吸煙產生的煙氣做為整體，通過動物和細胞中毒試驗，用毒理學的方法，對卷煙煙氣的健康影響進行評價。通過與同品質對照煙比較，檢驗降焦減害技術應用于卷煙中提高卷煙安全性的效果。

其他功能檢測實驗動物及其吸煙染毒實驗動物昆明小鼠和Wistar大鼠是我國“新藥審批辦法”推薦使用的動物。動物到達后，按SOPA034的要求接收。每籠5只，飼養(yǎng)在二級動物房內，溫度30±1℃，濕度60±5%。由獲得資格認可的人員飼養(yǎng)。所有動物按SOPA035要求檢疫觀察1-3天，在此時間內觀察動物的疾病和死亡指征，出現異常現象需向專題負責人和臨床獸醫(yī)報告。由實驗動物中心提供標準飼料。從動物到達至研究結束自由攝食。用飲水瓶供應消毒自來水，由動物自由飲用。每日沖洗飲水瓶吸煙染毒用吸煙器吸煙，將煙氣導入中毒室（有機玻璃盒），動物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻的條件下自由吸入卷煙煙氣，造成動物吸煙中毒的實驗模型用于實驗研究的靶細胞主要有鼠或人來源的成纖維細胞和上皮細胞四大類敘利亞地鼠胚胎細胞（SHE）優(yōu)點：易獲得，易培養(yǎng)，穩(wěn)定，經濟缺點：敏感性較差，結果難以外推到人人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）優(yōu)點：敏感性好，與人類接近缺點：難培養(yǎng)，費用高將吸煙器抽煙的煙氣，分別經過有機相（乙酸乙酯）和無機相（基本培養(yǎng)液）收集。將有機溶劑揮發(fā)后，與培養(yǎng)液混合，并將煙氣濃度調整為1支煙/ml，加入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，造成細胞煙氣中毒的實驗模型細胞系及其暴露卷煙煙氣染毒通常急性毒性是指動物1d內單次或多次染毒后在7~14d中連續(xù)觀察動物產生的毒性反應及死亡情況?？紤]到吸煙的實際情況，在吸煙的急性毒性實驗中，我們采用所有動物同時開始吸煙，連續(xù)染毒，直至全部動物死亡為止，觀察動物吸煙的反應，準確記錄每只動物的死亡時間和吸煙量，計算平均活存時間和平均致死吸煙量，提供以下實驗結果：第一只動物和最后一只動物死亡的時間和致死吸煙量（即死亡時間和劑量的范圍）一半動物發(fā)生死亡的時間和吸煙量（T1/2和LD50）對照煙動物全部死亡時，實驗煙動物的活存率必要時，需對急性致死動物的進行病理觀察動物暴露卷煙煙氣的急性毒性試驗細胞氧化損傷——活性氧檢測幾乎所有的環(huán)境有害因素均能通過直接或間接作用，誘發(fā)細胞產生包括活性氧在內的自由基，這一方面是由于外源性化合物的代謝活化，并與其細胞或基因毒性密切相關；另一方面是細胞應激性啟動抗氧化防御機制以對抗外源性有害因素可能導致的細胞損傷。細胞活性氧水平反應了細胞對外源性有害因素作用時的毒性應答，也就是外源性化合物的毒性細胞內活性氧水平細胞中，分子探針DCFH-DA和HE可分別與H2O2和O2.—反應，生成二氯熒光黃（DCF）和溴乙錠（EB），并產生綠色和紅色熒光，通過測定細胞內DCF和/或EB的熒光強度，即可相對定量細胞內H2O2和O2.—水平細胞外活性含量過氧化氫（H2O2）用辣根過氧化物酶和酚紅捕獲，通過標準曲線進行定量；超氧陰離子（O2.—）用細胞色素C捕獲，通過測定吸光度改變進行定量；羥自由基（.OH）用番紅花紅捕獲，通過測定吸光度改變進行定量過氧化氫細胞膜是細胞與外界的屏蔽，具有信號轉導與物質交換的重要功能。有人提出膜損傷是疾病發(fā)生甚至癌變的標志。細胞膜損傷可從以下幾個方面進行評價：膜的通透性

乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中的一種常見酶，通常情況下不能透過細胞膜外逸，因此，通過檢測細胞外LDH的活性，可以評價膜通透性的改變膜的結構與功能

腺苷三磷酸酶（ATPase）是細胞膜上的一種重要酶，負責重要離子的主動跨膜運輸。通過檢測細胞膜ATPase的活性，可以評價膜功能性的改變膜的流動性

采用熒光偏振法，細胞經DPH熒光探針標記后，用熒光分光光度計測熒光偏振度。Kex362nm,Kem432nm,狹縫10nm,測溫25℃細胞膜損傷長期毒性（也稱為亞急性毒性、亞慢性毒性、慢性毒性或終生毒性）是指動物反復多次染毒的毒性反應。實驗時，動物每天固定時間吸煙1次，按實驗設計要求控制吸煙時間和吸煙量，持續(xù)3個月后活殺一批，余下動物繼續(xù)飼養(yǎng)1個月進行恢復期觀察。分別在吸煙前、吸煙期間的1個月和2個月、停止吸煙時（吸煙后3個月）、停止吸煙后1個月（吸煙后4個月）觀察動物體重變化、血液學參數。實驗結束后，全部處死動物，進行肺組織病理學觀察。觀察指標包括一般觀察

外觀體征和行為活動（如神態(tài)萎靡、倦縮不動或過度興奮、躁動驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常等），皮毛帖身或稀疏豎散，糞便性狀、顏色，食量及體重變化等血液學指標

紅細胞或網織紅細胞細胞數，血紅蛋白含量，白細胞及其分類細胞數，血小板計數，凝血時間等血液生化指標

天氡氨酸氨基轉換酶（AST）、丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、肝酐（CREA）、總膽固醇（TCH）、鈣濃度（CA）等病檢器官

心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸(子宮)、腦、交列腺等的重量及其系數，以及部分器官的病理學檢查動物暴露卷煙煙氣的慢性毒性試驗Hchr11分帶AL細胞(×400)AL細胞染色體核型次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HPRT）主要參與嘌呤核苷酸的補救合途徑，正常細胞能從頭合成DNA，因此HPRT酶對細胞存活繁殖是非必需的，HPRT基因突變后仍能較長期活存。利用正常細胞中HPRT酶活性，加入毒性嘌呤類似物6-巰基鳥嘌呤（6-TG）培養(yǎng)，細胞死亡，而HPRT基因突變的細胞對6-TG有抗性而活存，并形成克隆，以此可以檢測HPRT基因突變人類11號染色體基因突變分析用人-中國倉鼠卵巢雜交細胞（AL細胞）檢測人類11號染色體（Hchr11）基因突變是近幾年發(fā)展起來的一種快速、簡便、經濟、靈敏的檢測基因突變的實驗方法基因突變細胞惡性轉化試驗

細胞轉化是是細胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細胞癌前病變的重要標志，表現在細胞增殖速度加快（倍增時間縮短），細胞間接觸抑制消失（疊層生長），并具有異種組織的浸潤性（轉移）。檢測細胞轉化能力是評價外源性化合物致癌性的基本方法動物致癌試驗

選擇腫瘤易感性高和腫瘤自然發(fā)生率低的純品系動物，常用小鼠和大鼠。年齡以剛斷乳為宜，因它們的易感性較高，同時也可具有較長的實驗觀察時間。計算癌瘤發(fā)生率，一般以病理組織診斷為依據，并與對照組相比較，以確定致癌的顯著性。確定誘癌潛伏期的長短以第一例癌瘤發(fā)現時間或平均癌瘤發(fā)現時間計。判定癌瘤多發(fā)性，應計數包括同一機體內發(fā)生兩種或兩種以上類型的腫瘤，或同一臟器、同一系統中出現多個同類型的癌瘤

致癌試驗代表性中式卷煙安全性評價舉例——煙絲添加神農液降低卷煙危害——使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害煙絲添加神農液降低卷煙危害的生物醫(yī)學評價——五葉神卷煙試驗樣品五葉神品牌卷煙

煙絲中添加2.5‰神農萃取液制成的卷煙(編號205#)同品牌對照煙

未使用神農萃取液的空白煙煙絲添加神農液降低卷煙危害對照煙五葉神煙動物數(只)3030動物體重(g)20.072.63

19.922.67

死亡時間(min)76.25~224.50

211.60~263.93

平均活存時間(min)180.0142.22

233.0611.57平均致死吸煙量(支)41.249.19

55.232.50

與同品質對照煙比較，吸五葉神煙組，小鼠的平均活存時間和平均致死吸煙量分別增加了29.4%和34.1%吸煙210min，五葉神煙組小鼠100%存活，而對照煙組小鼠存活率僅為40%，當對照煙組小鼠全都死亡時，五葉神煙組小鼠的存活率為高達86.7%

小鼠吸煙急性致死毒性試驗空白煙五葉神淋巴細胞浸潤1.830.581.000.71*肺泡壁增厚2.500.672.110.60出血2.250.452.780.67*氣管上皮變溥2.170.941.440.73肺囊泡1.920.671.110.78*管周水腫2.170.391.890.60肺損傷總分值

12.831.7510.331.00**n=6,與空白煙比較，*p<0.05,**p<0.005吸煙急性致死小鼠肺組織病理改變空白煙五葉神淋巴細胞浸潤3.400.552.800.45肺泡壁增厚2.200.451.800.45出血2.600.552.000.00*氣管上皮變溥3.200.841.600.55*肺囊泡2.600.551.600.55*管周水腫3.800.452.800.45*肺損傷總分值

17.800.4512.601.34***n=6,與空白煙比較，*p<0.05,***p<0.001吸煙急性致死大鼠肺組織病理改變小鼠大鼠正常肺組織

對照煙

五葉神

吸煙急性致死動物肺組織病理形態(tài)改變肺組織病理觀察結果表明，同為吸煙急性致死動物，五葉神煙組肺損傷程度明顯減輕，表現在淋巴細胞浸潤、肺泡壁增厚、出血、氣管擴張、上皮變薄、肺囊泡和管周水腫等多項病理損傷指標均明顯好于對照煙組五葉神及其對照煙的細胞毒性比較五葉神煙誘發(fā)SHE和BEAS-2B細胞增殖的半數致死劑量分別是對照煙的1.7倍和4倍。提示：五葉神煙的細胞毒性明顯降低不同細胞系對卷煙煙氣敏感性不同BEAS-2B細胞對空白煙的敏感性約是SHE細胞的11.5倍；而對五葉神煙的敏感性僅為SHE細胞的4.5倍：提示：五葉神卷煙煙氣中能被P450酶活化的有害物質降低？

過氧化氫（H2O2）超氧陰離子（O2.-）五葉神及其對照煙誘發(fā)細胞內ROS增高五葉神卷煙誘發(fā)細胞內過氧經氫和超氧陰離子增高的能力分別僅為對照煙的65%和60%。提示五葉神卷煙對細胞的氧化損傷顯著降低。不同種類活性氧對煙氣的敏感性不同：超氧陰離子的增高為過氧化氫的2.3倍五葉神煙誘發(fā)細胞產生的過氧化氫和超氧陰離子含量含量增高分別僅為同品質對照煙的40%和29%，羥自由基含量不僅明顯低于同品質對照煙，而且觀察到對羥自由基的清除(?)作用。表明五葉神卷煙對細胞的氧化損傷顯著降低。五葉神及其對照煙誘發(fā)細胞外ROS含量增高五葉神及其對照煙對膜通透性影響乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中一種常見酶，通常情況下不能透過細胞膜外逸，因此通過檢測細胞外LDH的活性，可以評價膜通透性的改變五葉神卷煙誘發(fā)細胞釋放的LDH活性增高僅為同品質對照煙的36%，表明五葉神卷煙對細胞膜損傷顯著降低。五葉神及其對照煙對細胞膜結構和功能影響腺苷三磷酸酶（ATPase）是細胞膜上的一種重要酶，負責重要離子的主動跨膜運輸。通過檢測細胞膜ATPase的活性，可以評價膜功能性的改變對照煙誘發(fā)細胞膜ATP酶活性的降低程度為五葉神煙的1.5倍，表明五葉神卷煙對細胞膜損傷明顯減輕?？侫TPase活性五葉神及其對照煙對細胞膜結構和功能影響不同ATP酶活性鈉/鉀-ATP酶鎂-ATP酶鈣-ATP酶鈣/鎂-ATP酶鈣、鎂-ATP酶是對煙氣敏感的指標除鈣-ATP酶外，五葉神煙對其他ATP酶的損傷作用明顯輕于對照煙神農萃取液含有活化鈉/鉀-ATP酶的活性成分(?)五葉神及其對照煙對Hchr11基因突變的影響人類11號染色體(Hchr11)對包含單拷貝Hchr11的人-中國倉鼠卵巢雜交細胞(AL細胞)的存活無明顯影響。利用Hchr11表達CD59表面抗原的特性，用CD59抗體可以篩選Hchr11基因突變的AL突變細胞，從而檢測Hchr11基因突變率。五葉神卷煙誘發(fā)Hchr11基因突變率明顯低于同品質對照煙，提示五葉神煙具有較低的基因毒作用。五葉神及其對照煙對HPRT基因突變的影響次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HPRT）對正常細胞DNA合成是非必需的，而HPRT基因突變體對基因毒物6-巰基鳥嘌呤具有抗性，以此可檢測HPRT基因突變。低劑量時，五葉神卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率與對照煙無明顯差異高劑量時，五葉神卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率明顯低于同品質對照煙五葉神及其對照煙誘發(fā)SHE細胞轉化的比較細胞轉化是細胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細胞癌前病變的重要標志。檢測細胞轉化能力是評價外源性化合物致癌性的基本方法。五葉神有2個連續(xù)劑量組（0.008和0.010）轉化率明顯增高，對照煙有3個連續(xù)劑量組（0.006、0.008和0.010）轉化率明顯增高。相同劑量下五葉神誘發(fā)的細胞轉化率明顯低于對照煙，誘發(fā)細胞轉化率增高的能力比對照煙減少50%。組別咳嗽次數(次)P值對照煙3支/d14.7±1.6五葉神煙1支/d14.0±1.7>0.052支/d13.2±2.4>0.053支/d12.3±2.2<0.05復方甘草合劑20ml/kg/d9.1±1.7<0.001減少氨水刺激小鼠致咳反應（治咳）延長喘息性抽搐潛伏期（平喘）組別潛伏期(min)P值對照煙3支/d39.6±5.8五葉神煙1支/d41.3±6.6>0.052支/d45.2±9.8>0.053支/d50.6±11.0<0.05陽性對照藥102.7±19.4<0.001組別酚紅排泌量P值對照煙3支/d0.59±0.027五葉神煙1支/d0.60±0.061>0.052支/d0.63±0.045>0.053支/d0.67±0.065<0.05淑芬氏劑20ml/kg/d0.98±0.18<0.001增加離體氣管酚紅排泌量（祛痰）改善瘀血組織的血液流動性組別全血粘度(CP)低切(20S)中切(60S)高切(120S)正常組10.62±1.897.59±1.045.96±0.65對照煙3支/d15.82±1.5610.32±0.728.06±0.71五葉神煙1支/d15.78±1.4110.14±0.657.82±0.392支/d14.09±2.039.30±1.167.20±0.873支/d13.55±2.219.29±1.287.12±0.85水20ml/kg/d13.12±1.719.15±1.107.16±0.90降低吸煙所致細胞染色單體交換（SCE）率組別SCE數范圍/細胞平均SCE數/細胞空白對照0~84.16±1.50溶劑對照2~94.28±1.60對照煙4~116.84±1.57五葉神煙3~95.50±1.73某外煙5~2011.42±3.15組別觀察細胞數微核數微核率空白對照組10000171.7‰對照煙組10136403.95‰實驗煙組10075252.48‰陽性對照組1019423523.05‰抑制吸煙所致細胞微核形成神農萃取液應用于卷煙中，使小鼠和大鼠吸煙急性死亡的時間和致死吸煙量分別增加了約60%和30%；特別是當吸對照煙組動物全部死亡時，五葉神煙組動物存活率高達85%以上同為吸煙急性致死動物，五葉神煙組肺損傷程度明顯減輕，表現在淋巴細胞浸潤、肺泡壁增厚、出血、氣管擴張、上皮變薄、肺囊泡和管周水腫等多項病理損傷指標均明顯好于對照煙組。與同品質對照煙比較，五葉神卷煙的細胞毒性降低了約2~4倍，誘發(fā)的細胞氧化損傷、膜損傷、染色體基因突變和細胞轉化等細胞生物學改變均明顯減輕與同品質對照煙比較，五葉神卷煙減少動物的刺激性咳嗽反應，延長喘息性抽搐的潛伏期，增加離體氣管酚紅排泌量，改善瘀血的血液流動性，降低了吸煙所致染色單體交換率，抑制吸煙所致微核形成結論使用SRM生物濾嘴降