竹節(jié)參皂苷抗風濕作用有效性與安全性評價

發(fā)現(xiàn)和甄別臨床前研究臨床研究申報及后續(xù)工作基礎和應用研究發(fā)現(xiàn)并篩選藥物來源藥學藥理學毒理學Ⅰ期臨床試驗Ⅱ期臨床試驗Ⅲ期臨床試驗填寫新藥申請后續(xù)登記活動

新藥研發(fā)項目IV期臨床試驗第一頁，共30頁。

臨床前研究前言有效性安全性總結

新藥臨床前研究的內容藥學

定型鑒別、定量測定、理化性質、合成路線和制劑工藝、穩(wěn)定性及質量標準草案制訂等。藥理學

藥效學、一般藥理學、藥代動力學及可能的作用機制研究。

毒理學

急性毒性、長期毒性、特殊毒性及其它毒性（刺激性、溶血、過敏、藥物依賴性、）研究

。第二頁，共30頁。一、類風濕性關節(jié)炎簡介

前言前言有效性安全性總結前言類風濕關節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，確切病因及發(fā)病機制尚不清楚。關節(jié)的疼痛與炎癥是風濕病中較為常見的臨床表現(xiàn)，因此鎮(zhèn)痛與抗炎是風濕病治療學中最主要的內容。常用藥物：常規(guī)藥物治療(如非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥、糖皮質激素)、生物制劑治療等第三頁，共30頁。二、竹節(jié)參簡介

前言前言有效性安全性總結前言竹節(jié)參在土家族苗族聚居區(qū)民間醫(yī)療中被譽為“草藥之王”,屬珍稀瀕危的名貴“七類”中草藥。竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖。作用：散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補虛強壯的功效，用于治療癆嗽咯血、跌撲損傷、咳嗽痰多、病后虛弱等癥。第四頁，共30頁。二、竹節(jié)參簡介

前言前言有效性安全性總結前言

竹節(jié)參的主要化學成分皂苷，其結構主要是齊墩果烷型五環(huán)三葩皂苷和達瑪烷型四環(huán)三萜皂昔。各類型三萜類皂苷的母核結構第五頁，共30頁。誘導式轉基因式自發(fā)式其他誘導式TNF-α轉基因型IL-1Ra-/-模型K/BxN轉基因模型HTLV-1小鼠模型MRL/Mpj-lpr/lpr(MRL/lpr)小鼠

降植烷誘導型膠原抗體誘導型前炎癥因子誘導型卵蛋白誘導型

角叉菜膠誘導型avridine誘導型蛋白多糖誘導型軟骨低聚體基質蛋白誘導型嚙齒類動物模型佐劑誘導型（AA）膠原誘導型（CIA）鏈球菌細胞壁誘導型（SCW）第六頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性實驗動物：SPF級昆明種小鼠,體重20±2g,雌雄各半。1.1抗炎實驗角叉菜膠所致小鼠足腫脹模型

(1)分組給藥

隨機分為五組,每組10只。Ⅰ組為control,Ⅱ組為吲哚美辛，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組為TSPJ低、中、高劑量組。

(2)角叉菜膠所致小鼠足腫脹模型按藥理實驗方法，各鼠右足趾皮下注射1%角叉菜膠(50μL/只)致炎。(3)

給藥方式本次試驗為預防性試驗,每組連續(xù)灌胃給藥10d,d10給藥后1h后致炎。(4)檢測指標在致炎后0.5,1,2,3,4,5h時采用自制的容量測定儀,以排水法計算其右足趾體積,計算各組的腫脹度和腫脹抑制率。第七頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性抗氧化實驗(1)分組給藥隨機分為五組,每組10只。I組為control,Ⅱ組為吲哚美辛,Ⅲ、IV、V組為TSPJ低、中、高劑量組。(2)給藥方式和時間本次試驗為預防性試驗,每組連續(xù)灌胃給藥10d。(3)檢測指標末次給藥后1h摘眼球取血,靜置，分離血清,分裝，-20℃保存。按GSH-PX、SOD和MDA試劑盒要求進行操作,分別檢測小鼠血清GSH-PX、SOD活性及過氧化產物MDA的含量。第八頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性細胞因子實驗(1)分組給藥隨機分為五組,每組10只。I組為control,Ⅱ組為吲哚美辛,Ⅲ、IV、V組為TSPJ低、中、高劑量組。(2)給藥方式和時間本次試驗為預防性試驗,每組連續(xù)灌胃給藥10d。(3)檢測指標末次給藥后1h摘眼球取血,分離血清,-20℃保存。按試劑盒操作方法,檢測小鼠血清IL-1、TNF-a含量。第九頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性1.2實驗結果竹節(jié)參總皂苷對角叉菜膠所致小鼠足腫脹的抑制結果角叉菜膠是常用的急性炎癥模型刺激物,局部注射引起明顯的毛細血管擴張、通透性增加,造成局部水腫,炎性細胞浸潤,形成"紅腫痛熱"等急性炎癥癥狀。使用吲哚美辛在致炎后0.5-4h就減輕足腫脹,持續(xù)5小時以上,與control組相比,差異具有顯著性(P<0.01),TSPJ能減輕角叉菜膠所致小鼠右后足的紅、腫等癥狀,有明顯差異(P<0.05或P<0.01),但是起效緩慢。見表1.1。第十頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性竹節(jié)參總皂昔對血清中GSH-PX、SOD活性及MDA含量的影響在本次試驗中,TSPJ能明顯提高機體抗氧化能力,GSH-PX活性和SOD活性明顯提高,對自由基的清除能力加強,自由基代謝產物MDA產生量明顯減少,從而對機體產生較好的保護作用,這也與其滋補強壯、抗炎、消腫止痛作用相符合。見表2.4。

第十一頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性竹節(jié)參總皂苷對小鼠血清中IL-1,TNF-a含量的影響如前所述,炎癥反應中除了前列腺素外,IL-1、TNF-a等其他炎癥因子也參與炎癥網絡并且可能發(fā)揮著至關重要的作用,在實驗中發(fā)現(xiàn),吲哚美辛組小鼠血清中IL-1、TNF-a水平明顯下降,與control組比較,差異性極顯著(P<0.001),表明吲哚美辛參與了干擾IL-1、TNF-a的生成,TSPJ組小鼠血清TNF-a水平下降,差異性顯著(P<0.01),對IL-1影響不大,原因不明。第十二頁，共30頁。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實驗研究

前言有效性總結安全性1.3竹節(jié)參總皂苷對小鼠抗炎作用實驗結果分析

結果表明,竹節(jié)參總皂苷中高劑量均能明顯減輕角叉菜膠所致小鼠右后足的紅、腫等癥狀,與control組比較,50mg/kgTSPJ組在致炎后1~3h,100mg/kgTSPJ組在致炎后0.5~4h能減輕小鼠足腫脹,有明顯差異。TSPJ三個劑量組的小鼠血清MDA明顯降低(P<0.05),有量效關系;竹節(jié)參總皂苷能恢復小鼠血清中GSH-PX、SOD的活力,提示TSPJ具有減少炎癥反應時自由基生成,抑制脂質過氧化反應的作用。各類細胞因子在炎癥反應中有重要功能,IL-1,TNF-a能促進內皮細胞表達黏附分子,增進白細胞與之粘著,也可引起急性炎癥的發(fā)熱,TNF還能促進中性粒細胞聚集和激活間質組織釋放蛋白水解酶。本實驗中TSPJ治療組小鼠血清IL-1、TNF-a水平明顯下降水平下降,因此抑制IL-1、TNF-a的生成可能是竹節(jié)參總皂苷抗炎作用機制之一。

綜上所述,TSPJ具有明顯的抗炎功能,抑制IL-1、TNF-a的生成可能是竹節(jié)參總皂苷抗炎作用的重要機制。第十三頁，共30頁。二、竹節(jié)參總皂苷對CIA大鼠組織病理學及超微結構改變的影晌

前言有效性總結安全性實驗動物：SPF級Wistar大鼠,體重200±10g,雌雄各半。2.1試驗方法2.1.1動物分組及處理

A. 正常組:注射液為無菌液體石蠟;B. 模型組:制作CIA大鼠模型;C. 雷公藤組:制作CIA大鼠模型,按雷公藤甲素計25μg/kg灌胃給藥;D.TSPJ小劑量組:制作CIA大鼠模型,竹節(jié)參總皂苷25mg/kg灌胃給藥;E. TSPJ中劑量組:制作CIA大鼠模型,竹節(jié)參總皂苷50mg/kg灌胃給藥;F. TSPJ大劑量組:制作CIA大鼠模型,竹節(jié)參總皂苷100mg/kg灌胃給藥;2.1.2動物模型

膠原誘導型（CIA）第十四頁，共30頁。二、竹節(jié)參總皂苷對CIA大鼠組織病理學及超微結構改變的影晌

前言有效性總結安全性2.2觀察項目關節(jié)炎病變程度足爪容積的測定大鼠體重變化免疫器官重量檢測

ConA誘導的CIA大鼠脾淋巴細胞增殖反應的測定

CIA大鼠脾淋巴細胞IL-2的誘生與檢測2.2.7CIA大鼠腹腔巨噬細胞(PMΦ)產生IL-1、IL-6.TNF-a的含量

CIA組織病理組織學檢測關節(jié)超微結構的觀察關節(jié)滑膜組織中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的檢測第十五頁，共30頁。二、竹節(jié)參總皂苷對CIA大鼠組織病理學及超微結構改變的影晌

前言有效性總結安全性2.3結果

TSPJ各劑量組AI評分也隨著繼發(fā)性炎癥的產生而升高,但與同期的模型組比較有顯著性差異,提示竹節(jié)參總皂苷具有抗CIA的作用,具有量效關系,但TSPJ并無快速消除炎癥癥狀的作用,且治療效果比雷公藤治療組稍差。使用TSPJ后,各劑量組腫脹程度從縱向來看,也隨著繼發(fā)性炎癥的產生而增加,但與同期的模型組(橫向比較)比較有顯著性差異,提示竹節(jié)參總皂苷具有抗CIA的作用,且具有量效關系,但治療效果比雷公藤治療組稍差。

CIA模型組體重增長速度減慢或停止,與正常組比較,差異有顯著性(P<0.05),雷公藤治療組體重增長速度也出現(xiàn)減慢現(xiàn)象,

TSPJ各組體重增長速度基本正常。

CIA模型可導致機體免疫功能亢進;TSPJ都具有使亢進的免疫功能恢復正常的作用,而雷公藤則直接抑制免疫器官的發(fā)育和增長。

ConA誘導的CIA大鼠脾臟T淋巴細胞增殖反應明顯低于正常對照組，TSPJ給藥可以恢復CIA大鼠脾淋巴細胞功能,TPT對CIA大鼠低下的脾淋巴細胞增殖反應沒有明顯影響。

TSPJ可使CIA大鼠脾淋巴細胞低下的IL-2水平恢復接近正常組大鼠水平,對照藥TPT的作用不顯著。第十六頁，共30頁。二、竹節(jié)參總皂苷對CIA大鼠組織病理學及超微結構改變的影晌

前言有效性總結安全性

TSPJ大中劑量能明顯抑制PMΦ產生IL-lβ、IL-6和TNF-a;提示治療劑量的TSPJ可以不同程度地下調致炎細胞因子水平,阻斷炎癥通路的惡性循環(huán)。

TSPJ各劑量組病理切片總體情況:皮下軟組織充血水腫減輕,組織間可見少許的炎性細胞浸潤,關節(jié)囊結構完整,關節(jié)腔內未見明顯的纖維蛋白沉積,關節(jié)滑膜間可見少量炎性細胞,部分滑膜仍有一定程度的增生,軟骨細胞未見明顯增生現(xiàn)象,未見明顯骨小梁溶蝕和骨膠原降解現(xiàn)象。

TSPJ組:各劑量組的滑膜層細胞性內膜無增厚,細胞層數(shù)接近正常,細胞排列均勻,偶見少量淋巴細胞浸潤,細胞間未見明顯的膠原纖維增生,超微結構基本正常。

TSPJ各劑量組關節(jié)滑膜ICAM-1表達數(shù)目、面積總和、積分光密度值及平均黑度值均低于模型對照組,且有著性差異(P<0.05或P<0.01),說明TSPJ具有降低CIA關節(jié)炎癥損傷的作用,其總體效果與陽性對照藥TPT無明顯差異。第十七頁，共30頁。三、結論

前言有效性總結安全性竹節(jié)參具有以下作用:(1)提高機體抗氧化能力,減少自由基對炎癥組織的損傷;(2)具有減輕炎癥組織中炎癥介質PGE和LTB的作用;(3)使炎癥組織中細胞因子如IL-1B、IL-6.TNF-a等明顯減少;(4)減輕炎癥組織中ICAM-1的產生,使炎癥部位不產生粘連;(5)對免疫系統(tǒng)具有"雙向調節(jié)作用",在治療過程中使亢進的免疫功能下調至正常,不會產生類似雷公藤和其他免疫抑制劑導致的免疫功能減退。第十八頁，共30頁。一、毒性作用類別藥物不良反應副反應后遺效應停藥反應毒性反應變態(tài)反應特異質反應致癌性致畸性致突變性毒性作用藥源性疾病總結前言有效性安全性第十九頁，共30頁。二、臨床前毒理學評價主要內容急性毒性、長期毒性、特殊毒性、局部用藥毒性、過敏試驗、刺激性試驗、藥物依賴性試驗。總結前言有效性安全性第二十頁，共30頁。三、竹節(jié)參皂苷粗提物毒性總結前言有效性安全性1.1實驗材料1.1.1藥物、細胞與試劑

藥物：竹節(jié)參皂苷提取物

細胞：小鼠單核巨噬白血病細胞株RAW264.7試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、一氧化氮(NO)檢測試劑盒1.2實驗方法

細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞株的復蘇：用75%酒精擦拭超凈工作臺,紫外線照射超凈工作臺30min,從液氮罐中取出凍存管,迅速將凍存管放到已經預熱的水浴鍋(37℃)中迅速解凍,不斷搖動,待凍存管內液體完全溶解(控制在1min內),取出用酒精棉球擦拭凍存管外壁,再拿入超凈臺內,將凍存管內的液體轉入15mL離心管,加入2倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,800r/min離心5min,棄去上清液,重懸細胞,接種到培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。傳代：待細胞長至90%后,從培養(yǎng)箱內取出細胞,小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗,加入3mL10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,用細胞刮棒沿一個方向輕輕將細胞刮下來,將細胞懸液轉移到15mL離心管中,800r/min離心5min,棄去上清液,加入培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液,分裝入培養(yǎng)瓶后,放入培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。凍存：當細胞長至80%～90%時,將細胞收集起來,將胎牛血清與二甲基亞砜(DMSO)按照9∶1的比列配制好凍存液。然后每管中加入2mL凍存液轉移至凍存管中,依次放在4℃中40min、-20℃中40min、-80℃過夜,第2日轉移至液氮灌中保存。第二十一頁，共30頁。竹節(jié)參皂苷粗提物不僅毒性小,而且其抗炎效果最好。三、竹節(jié)參皂苷粗提物毒性總結前言有效性安全性RAW264.7細胞活力測定將RAW264.7接種于96孔板,細胞數(shù)為105個/mL,每孔100μL,貼壁后,設置調零孔(只有培養(yǎng)液)、正常組、給藥組,給藥濃度為5、10、20、40、80μg/mL,每組4個復孔,24h后吸取上清液,在每孔中加入含MTT的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后將上清去掉,每孔加入150μLDMSO,置搖床上低速震蕩10min,使結晶充分溶解,在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔吸光度。1.2.3RAW264.7細胞一氧化氮釋放量測定

將RAW264.7接種96孔板,細胞數(shù)為105個/mL,每孔100μL,貼壁后,同時加入不同提取工藝的竹節(jié)參皂苷(濃度為10、1μg/mL)和1μg/mLLPS作用,設為空白組、LPS組、LPS＋竹節(jié)參皂苷組,每組4個復孔,24h后,取上清液50μL,依次加入GriessⅠ和GriessⅡ各50μL,37℃恒溫箱中反應30min,在酶聯(lián)免疫檢測儀540nm處測量各孔吸光度。1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示,采用方差分析進行多組間差異比較,以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。在炎癥反應中,NO是判斷炎癥最基本的指標第二十二頁，共30頁。四、竹節(jié)參提取物對大鼠長期毒性總結前言有效性安全性

長期毒性動物實驗一般指連續(xù)給藥14d以上。本實驗觀察竹節(jié)參提取物灌胃給予大鼠90、180d及恢復30d的毒性反應，考察大鼠長期給藥的安全性，為竹節(jié)參臨床用藥安全性評價提供實驗依據(jù)。2.1實驗材料2.1.1藥物、動物

藥物：竹節(jié)參

實驗動物：SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量(150±10)g2.2實驗方法

竹節(jié)參提取物的制備

將竹節(jié)參干燥根莖粉碎后，用60%乙醇回流提取3次后，回收乙醇，合并濾液，濃縮，得到竹節(jié)參提取物，提取率為25.8%。2.2.2動物分組及給藥方法

將96

只大鼠按體重隨機分為4組，每組24只，雌雄各半，分別為竹節(jié)參提取物低、中、高劑量(生藥3．2、6．4、12．8g·kg－1

)組，相當于臨床成人用量的25、50、100倍，另設對照組。適應性飼養(yǎng)1周后，對照組給予蒸餾水，給藥組給予相應劑量的竹節(jié)參提取物。給藥體積為1.0mL·kg－1

，每天1次，每周6次，連續(xù)給藥180d，停藥后恢復30d。分別于給藥第90、180d以及停藥恢復30d，每組各取8只大鼠，20%烏拉坦麻醉(0。7mL/100g)后于腹主動脈取血，分離血清做血液生化指標檢測;同時取大鼠主要臟器進行系統(tǒng)觀察和組織病理學檢查。第二十三頁，共30頁。四、竹節(jié)參提取物對大鼠長期毒性總結前言有效性安全性2.2.3大鼠一般狀況、進食量及體重觀察

每天觀察大鼠一般狀況，包括外觀體征、行為活動、食欲、大小便;每天記錄大鼠進食量;每周稱量大鼠體重1次。2.2.4血液學檢查大鼠腹主動脈取血后檢測凝血酶原時間(PT)、白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(HCT)和血小板數(shù)目(PLT)等。2.2.5血液生化學檢查大鼠腹主動脈取血，3000r·min－1離心10min取上層得到血清，用全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總膽固醇(TCHO)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)等主要生化學指標。

系統(tǒng)解剖、臟器指數(shù)檢查和組織病理學檢查大鼠處死后，立即取出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺、腎上腺，稱重后計算臟器指數(shù)。另取胃、十二指腸、甲狀腺、胰腺、附睪、前列腺，與心臟等組織一同放入4%多聚甲醛溶液中固定24h后，轉入70%乙醇中，進行脫水、包埋，組織切片、HE染色，于光鏡下進行組織病理學檢查。2.2.7統(tǒng)計學分析所有實驗結果的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，以單因素方差分析(one-wayANOVA)并進行多組間差異比較，行Dunnett-t檢驗，暫未考慮調整顯著性水準。第二十四頁，共30頁。四、竹節(jié)參提取物對大鼠長期毒性總結前言有效性安全性2.3

結果2.3.1對大鼠一般狀況、進食量和體重的影響

給藥期和恢復期間，各組動物外觀正常，活動自如，各劑量組大鼠體重、攝食量和糞便等均未見明顯異常。大鼠體重呈穩(wěn)定增長趨勢，與對照組比較，各劑量組大鼠無顯著性差異(見表1)。結果提示竹節(jié)參提取物對大鼠一般狀況、進食量和體重的進食量和體重無明顯影響。第二十五頁，共30頁。四、竹節(jié)參提取物對大鼠長期毒性總結前言有效性安全性2.3.2對大鼠血液學指標的影響

實驗結果如表2所示，給藥期間，與對照組比較，竹節(jié)參提取物中、高劑量組WBC和HCT均明顯增加，具有統(tǒng)計學意義(P

＜0.05或P

＜0.01)