00環(huán)境工程微生物學(xué)講稿HG（07微生物的遺傳和變異）

第六章

微生物的遺傳和變異

第一篇微生物學(xué)基礎(chǔ)主要內(nèi)容：微生物的遺傳和變異現(xiàn)象微生物的遺傳微生物的變異及應(yīng)用第一節(jié)遺傳和變異現(xiàn)象遺傳和變異是一切生物最本質(zhì)的屬性。

遺傳（保守性）變異

遺傳學(xué)(Genetics)：研究生物遺傳和變異現(xiàn)象的學(xué)科。意義：遺傳和變異是一切生物存在和進(jìn)化的基本要素對于育種的意義在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用遺傳是相對的，變異是絕對的；

遺傳中有變異，變異中有遺傳。

第二節(jié)微生物的遺傳

一、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)－－DNA1、對DNA的認(rèn)識和研究歷史孟德爾的理論豌豆實(shí)驗(yàn)孟德爾定理的重新發(fā)現(xiàn)DNA（及RNA）是遺傳物質(zhì)的研究歷史（三個經(jīng)典實(shí)驗(yàn)）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

Griffith(1928)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。后Avery等（1944）證實(shí)，引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)就是DNA。噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（1952年）FraenkelConrat(1956)用RNA病毒做的病毒重建實(shí)驗(yàn)證明，在只有RNA而不含DNA的病毒中，遺傳物質(zhì)是RNA。2、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在形式

除部分病毒的遺傳物質(zhì)是RNA外，其余病毒和全部具有典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體的遺傳物質(zhì)都是DNA。按其在細(xì)胞中的存在形式可分成染色體DNA和染色體外DNA。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中DNA的存在形式不完全相同。3、基因和遺傳信息的傳遞

基因現(xiàn)在一般認(rèn)為，基因是一個具有遺傳因子效應(yīng)的DNA片段，它是遺傳物質(zhì)的最小功能單位?；蚴巧锶旧w上的一段DNA，它儲存了遺傳信息，又具有自我復(fù)制的能力?；蚓哂刑囟ǖ膲A基順序，即核苷酸順序，它不僅可以決定生物的某一個性狀，而且還具有調(diào)控其他基因表達(dá)活性的功能?；蚣仁且粋€結(jié)構(gòu)單位，也是一個功能單位。按功能可把基因分為三種：結(jié)構(gòu)基因、操縱基因、調(diào)節(jié)基因?；蚩刂七z傳性狀，但不等于遺傳性狀。任何一個遺傳性狀的表達(dá)都是在基因控制下的個體發(fā)育的結(jié)果。從基因型到表現(xiàn)型需要通過酶催化的代謝活動來實(shí)現(xiàn)?；蛑苯涌刂泼傅暮铣?，控制新陳代謝，從而決定遺傳性狀的表現(xiàn)。

性狀（表型）=基因型+環(huán)境(2)遺傳信息的傳遞現(xiàn)代生物遺傳學(xué)已經(jīng)證明：

親代的性狀是通過脫氧核糖核酸（DNA）將決定各種遺傳性狀的遺傳信息傳給子代的。子代根據(jù)DNA所攜帶的遺傳信息，產(chǎn)生一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，由一定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)就可決定子代具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特性。分子生物學(xué)中心法則二、DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制1、DNA的結(jié)構(gòu)DNA由兩條多個核苷酸組成的鏈配對而成，兩條鏈彼此互補(bǔ)，以右手螺旋的方式圍繞一根主軸而互相盤繞形成。四種堿基A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、G（鳥嘌呤）、C（胞嘧啶）相互配對。A~T,G~C互相間通過氫鍵連接。核苷酸的結(jié)構(gòu)四種堿基的結(jié)構(gòu)DNA分子結(jié)構(gòu)DNA鏈的延伸A與T、G與C的配對（依靠氫鍵連接）2、DNA的復(fù)制為確保微生物體內(nèi)DNA堿基順序精確不變，保證微生物的所有屬性都得到遺傳，則在細(xì)胞分裂之前，DNA必須十分精確地進(jìn)行復(fù)制。DNA具有獨(dú)特的半保留式的自我復(fù)制能力，確保了DNA復(fù)制精確，并保證一切生物遺傳性的相對穩(wěn)定。DNA的復(fù)制DNA是雙鏈分子，但作為基因則只有一條鏈為蛋白質(zhì)編碼（意義鏈），另一條只是使DNA分子處于穩(wěn)定狀態(tài)的互補(bǔ)鏈，稱為反義鏈。由DNA分子上的堿基順序通過轉(zhuǎn)錄過程決定RNA分子。

三、DNA的變性和復(fù)性

DNA的變性：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)由堿基對中堿基之間的氫鍵維持。當(dāng)天然雙鏈DNA受熱或其他因素的作用下，兩條鏈之間的結(jié)合力被破壞而分開成單鏈DNA，即稱為DNA變性。解鏈溫度Tm：DNA的復(fù)性：變性DNA溶液經(jīng)適當(dāng)處理后重新形成天然DNA的過程叫復(fù)性，或叫退火。用高溫使DNA變性后，再緩慢降低至自然溫度，變性的DNA會復(fù)性成天然雙鏈DNA。DNA的變性DNA變性時，雙螺旋松解，堿基暴露，OD260值增加（增色效應(yīng)）。DNA復(fù)性時，單鏈DNA重新恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，OD260值減?。p色效應(yīng)）。DNA復(fù)性DNA變性與復(fù)性的應(yīng)用：測定G+Cmol%分子雜交核酸探針……四、RNA及其作用RNA（核糖核酸）和DNA很相似，不同的是以核糖代替脫氧核糖，以尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。RNA由DNA轉(zhuǎn)錄而來。RNA主要有三種：tRNA、rRNA、mRNA，在蛋白質(zhì)合成過程中擔(dān)任不同的角色。另外還有一種反義RNA，主要起調(diào)節(jié)作用。RNA來自DNA，通過轉(zhuǎn)錄過程生成相應(yīng)的RNA，RNA上的堿基序列是由DNA所決定的。許多實(shí)驗(yàn)證明，在體內(nèi)DNA兩條鏈中僅有一條鏈可用于轉(zhuǎn)錄；或者某些區(qū)域以這條鏈轉(zhuǎn)錄，另一些區(qū)域以另一條鏈轉(zhuǎn)錄。用于轉(zhuǎn)錄的鏈稱為模板鏈，或負(fù)鏈（-鏈，反義鏈）；對應(yīng)的鏈為編碼鏈，即正鏈（+鏈，有義鏈）。編碼鏈與轉(zhuǎn)錄出來的RNA鏈堿基序列一樣，只是以尿嘧啶取代胸腺嘧啶，它無轉(zhuǎn)錄功能，只能進(jìn)行復(fù)制。轉(zhuǎn)錄mRNA(信使

RNA)tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)rRNA（核糖體RNA）由mRNA、tRNA和rRNA協(xié)作,合成蛋白質(zhì)。

另外，還有一種反義RNA，它起調(diào)節(jié)作用，決定mRNA翻譯合成速度。核酸和蛋白質(zhì)的合成遺傳密碼：遺傳密碼是由三個核苷酸組成的三聯(lián)密碼，mRNA上從5’端到3’端的核苷酸排列序列決定了蛋白質(zhì)多肽鏈中從N端到C端的氨基酸排列序列。

DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關(guān)系DNA鏈的正鏈（編碼鏈）上的堿基序列5’-------3’

負(fù)鏈（模板鏈）上的堿基序列3’-------5’

對應(yīng)mRNA上的堿基序列5’-------3’

對應(yīng)多肽上的氨基酸序列N-------C五、微生物生長與蛋白質(zhì)合成微生物生長的主要活動是蛋白質(zhì)的合成，同化的碳和消耗的能量有4/5~9/10直接或間接與蛋白質(zhì)合成有關(guān)。蛋白質(zhì)合成(翻譯)在核糖體上進(jìn)行，與RNA的復(fù)制（合成）及DNA的復(fù)制（合成）有關(guān)。蛋白質(zhì)合成過程：

DNA復(fù)制：相應(yīng)的DNA鏈進(jìn)行自我復(fù)制；轉(zhuǎn)錄mRNA：由DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，同時也轉(zhuǎn)錄成其他幾種RNA；翻譯：由tRNA完成；蛋白質(zhì)合成：合成多肽，最終生成具有特定功能的蛋白質(zhì)。六、微生物的細(xì)胞分裂由于DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，兩者增加，最后導(dǎo)致微生物細(xì)胞的分裂。微生物將成倍增加的核物質(zhì)和蛋白質(zhì)均等地分配給兩個子細(xì)胞，在細(xì)胞中部形成橫隔膜，最終分裂成兩個細(xì)胞。第三節(jié)微生物的變異

一、變異的實(shí)質(zhì)廣義的突變包括：（1）染色體數(shù)目變異（2）染色體重排（缺失、重復(fù)、易位和倒位等（3）基因突變（狹義的突變）在微生物中，基因突變是發(fā)生變異的主要途徑：在微生物遺傳過程中，由于某種因素的影響，DNA上的堿基對發(fā)生差錯，出現(xiàn)堿基的缺失、置換或插入，改變了基因內(nèi)原有的堿基順序，導(dǎo)致后代性狀的改變。當(dāng)這種改變可以遺傳時，就是發(fā)生了突變。突變株（突變體）：帶有基因突變的菌株。在真核微生物中，變異也會發(fā)生在染色體水平上，如染色體的缺失、重復(fù)、倒位和易位等，都會引起遺傳信息的改變，稱為染色體畸變。點(diǎn)突變：只涉及DNA分子中一個或少數(shù)堿基的改變。二、突變的類型突變的特點(diǎn)：基因突變的特點(diǎn)概括起來有三點(diǎn)，即稀有性、隨機(jī)性和可逆性。突變的類型自發(fā)突變(spontaneousmutagenesis)

在自然條件下發(fā)生的突變。自發(fā)突變的概率很低（突變型頻率），如細(xì)菌約為10-10。

誘發(fā)突變(inducedmutagenesis)人為地用某種因素處理后造成的突變。凡能提高突變率的因素稱為誘發(fā)因素或誘變劑。誘發(fā)突變的概率大大提高，可以達(dá)到約10-4-1×10-5物理誘變，如紫外線?；瘜W(xué)誘變，利用化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)突變。DNA損傷的修復(fù)：當(dāng)DNA分子被損傷后，細(xì)胞會利用某種方式進(jìn)行修復(fù)，以保證遺傳信息的正確傳遞。當(dāng)然這種修復(fù)的程度有限的。DNA的損傷修復(fù)有5種方式：(a)光復(fù)活(b)切除修復(fù)(c)重組修復(fù)(d)SOS修復(fù)(e)適應(yīng)性修復(fù)紫外輻射對DNA的損傷和DNA的修復(fù)

突變的應(yīng)用可進(jìn)行定向培育和馴化。人為地用某種特定的環(huán)境條件長期處理某一微生物群體，并進(jìn)行傳種接代，積累和選擇合適的自發(fā)突變體。在環(huán)境工程中，常采用定向培育的方法來培育菌種（馴化）。三、基因重組基因重組是改變微生物遺傳性狀的另一途徑。把來自不同性狀的個體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到一起，使基因重新組合，產(chǎn)生新品種，稱為基因重組或遺傳重組。在基因重組過程中，兩個不同性狀的個體細(xì)胞，其中一個細(xì)胞(供體細(xì)胞)的DNA與另一個細(xì)胞(受體細(xì)胞)的DNA融合，使基因重新排列，遺傳給后代，產(chǎn)生新品種或表達(dá)新的遺傳性狀。（基因沒有變化，只是重新排列）在真核生物中，二個配子相互融合的有性過程中發(fā)生基因重組（雜交）。在細(xì)菌中，不存在類似高等生物的有性過程，但也有基因重組的發(fā)生。在微生物中，基因重組的方式主要是轉(zhuǎn)化(transformation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)、接合(conjugation)和原生質(zhì)體融合等。重組是分子水平上的一個概念，可以理解為遺傳物質(zhì)分子水平的雜交?，F(xiàn)在人們不僅能在同種或相似物種間實(shí)現(xiàn)基因重組，而且已經(jīng)能夠在親源關(guān)系很遠(yuǎn)的生物間實(shí)現(xiàn)基因重組。1、原核微生物的基因重組（1）轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換將其整合到自己的基因組中，從而獲得新的遺傳特性。轉(zhuǎn)化的條件：受體菌（處于感受態(tài)）

外源DNA（相對高的分子質(zhì)量和同源性）轉(zhuǎn)化過程：出現(xiàn)感受態(tài)細(xì)胞→DNA吸附→DNA進(jìn)入細(xì)胞→DNA解鏈→形成受體DNA-供體DNA復(fù)合物→DNA復(fù)制和分離（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)以噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換和整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀。媒介------轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（3）接合供體菌和受體菌通過完整細(xì)胞間的直接接觸而實(shí)現(xiàn)大段DNA的傳遞。如在E.coli中的F因子（決定性別的質(zhì)粒）（由F因子帶動的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程也稱為F轉(zhuǎn)導(dǎo)）2、真核微生物的基因重組真核微生物可以進(jìn)行有性生殖，所以DNA的轉(zhuǎn)移和重組在許多方面與原核微生物不同，由于真核微生物細(xì)胞核復(fù)雜，基因組由多條染色體組成，由此其分配和分離有著更復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。盡管真核微生物的基因重組主要有有性生殖、準(zhǔn)性生殖、原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化等形式，但以有性生殖和準(zhǔn)性生殖更為常見。有性生殖：性細(xì)胞間的接合和隨之產(chǎn)生的染色體重組，并產(chǎn)生新的遺傳型后代在有性生殖過程中，通過減數(shù)分裂和接合，導(dǎo)致基因重組。如：能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌等準(zhǔn)性生殖：在一些真菌中發(fā)生，主要是其染色體減少的過程不是通過減數(shù)分裂，而是其他方式丟失。上表中不包括經(jīng)過酶的處理而去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體融合，以及由融合而帶來的基因重組。四、微生物育種根據(jù)菌種的遺傳特點(diǎn)，改良菌株的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量不斷提高。1、誘變育種采用物理和化學(xué)因素處理微生物，使之發(fā)生突變，并運(yùn)用合理的篩選程序和方法，把適合人類需求的優(yōu)良菌株選育出來。基本環(huán)節(jié)包括：挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株

簡便有效的誘變劑

處理單孢子（細(xì)胞）菌懸液

選用合適的劑量充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)設(shè)計或采用高效篩選方案檢測和篩選方法是關(guān)鍵。利用一些形態(tài)、生理的方面的特性，將發(fā)生突變的菌株挑選出來。如營養(yǎng)缺陷型的篩選，可以采用影印法（圖）。影印平板技術(shù)（正常菌E.coli）注：圖中紅色實(shí)心者為正常菌落；藍(lán)色實(shí)心者為突變株2、原生質(zhì)體融合育種通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、穩(wěn)定的融合子。能進(jìn)行原生質(zhì)體融合的細(xì)胞及其廣泛，不僅包括原核微生物，也包括真核細(xì)胞。對接合型或致育型的限制比較小，有利于不同種屬間微生物的雜交。原生質(zhì)體融合打破了種屬界限，可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組。原生質(zhì)體融合將二親株細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行融合，遺傳物質(zhì)的交換更為完整，提高菌株產(chǎn)量的潛力更大。3、基因工程育種基因工程技術(shù)比其他育種方法更有目的性和方向性，效率更高。將在下面進(jìn)行講述。五、基因工程基因工程的基本概念基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，又叫基因剪接或核酸體外重組。基因工程是離體的分子水平上的基因重組，是既可近緣雜交又可遠(yuǎn)緣雜交的育種新技術(shù)。GMO:轉(zhuǎn)基因生物(geneticallymodifiedorganism)

基因工程的操作步驟：1.先從供體細(xì)胞中選擇獲取帶有目的基因的DNA片段；

2.將目的DNA的片段和質(zhì)粒在體外重組；

3.將重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；4.重組體克隆的篩選與鑒定；

5.外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與提純。

基因工程的操作步驟基因工程的操作步驟（DNA體外基因重組）七、PCR技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用PCR(polymerasechainreaction)稱DNA聚合酶鏈反應(yīng)。于1985年由美國Millus創(chuàng)立。PCR是DNA不需通過克隆而在體外擴(kuò)增，短時間內(nèi)合成大量DNA片段的技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：PCR檢測速度快，只需5～6h出結(jié)果。

環(huán)境中存在各種生物的DNA，量少。采集到少量DNA，加入引物和DNA多聚酶，經(jīng)過變性和復(fù)性（退火）的過程，可在體外擴(kuò)增至足以供檢測、鑒定所需的用量。應(yīng)用:

法醫(yī)鑒定、醫(yī)學(xué)、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境檢測等方面。1、PCR技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)是一種具有選擇性的體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。2、PCR技術(shù)的操作PCR要求反應(yīng)體系具有下列條件：①要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的DNA引物（約20個堿基左右）；②具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；③4種脫氧核糖核苷酸dNTP；④作為模板的目的DNA序列。一般的PCR技術(shù)可以擴(kuò)增出100-5000bp的目的基因，PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。PCR儀每個PCR循環(huán)包括以下反應(yīng)：①雙鏈DNA的變性，通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火，當(dāng)溫度突然降低使引物和其互補(bǔ)的模板鏈在局部形成雜交鏈，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，因此模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會較少；③延伸，在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的5’→3’的DNA鏈延伸反應(yīng)。PCR技術(shù)的操作步驟以上3步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板。每個循環(huán)可使目標(biāo)DNA數(shù)量加倍。實(shí)際操作中，經(jīng)過20~30個循環(huán)，可使目標(biāo)DNA增加106~109。DNA的分離和觀察：凝膠電泳（Gelelectrophoresis）在外加電場的作用下，線性的DNA分子在一種被稱為凝膠基質(zhì)（gelmatrix）的果凍樣惰性多孔物質(zhì)中，按照其分子大小被分開，由于DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中，它們向正極遷移。凝膠基質(zhì)中網(wǎng)孔的大小，決定了DNA分子的遷移速度，大分子要比小分子慢。DNA的凝膠電泳儀電泳完成后，用熒光染料如溴化乙錠（ethidiumbromide）對凝膠進(jìn)行染色。通常