顯微鏡的使用、細(xì)菌單染色及革蘭氏染色

實驗三顯微鏡的使用、細(xì)菌單染色及革蘭氏染色姓名：賈曉霖學(xué)號：201000140032班級：生科10.1同組者：李江湲程子修洪鈞燁一、 實驗?zāi)康?、 學(xué)習(xí)顯微鏡（油鏡）的使用方法。2、 學(xué)習(xí)微生物制片及染色技術(shù)。3、 認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征。4、 了解革蘭氏染色的原理，掌握革蘭氏染色法。二、 實驗原理原理一：單染色法單染色即用單純的種染料進(jìn)行染色，多數(shù)采用美藍(lán)、結(jié)晶紫或石碳酸復(fù)紅等堿性染料。此法僅能顯示細(xì)胞的外部形態(tài)，而不能辨別其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。染色前必須將細(xì)胞固定，其目的是殺死細(xì)菌，并使它粘附在載玻片上。此外，還可以增加菌體對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。無論用哪種方法都應(yīng)盡量使細(xì)菌維持原有的形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。原理二：革蘭氏染色法革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示：染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。堿性染料初染液的作用像在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上，使不易脫落，碘是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95%的酒精。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G+和G兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。三、 實驗器材1、菌種大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽抱桿菌，自選菌。2、 溶液和試劑革蘭氏染液，結(jié)晶紫染液，碘液，95%乙醇，番紅復(fù)染液等。3、 儀器和其他用品酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，試管架等。四、內(nèi)容1、顯微鏡構(gòu)造及使用油鏡的使用法：1、 使用顯微鏡油鏡時，必須將顯微鏡端正直立桌上，不得將鏡臂彎曲，使載物臺傾斜，以免香柏油流溢，影響觀察，污染臺面。2、 對光：首先打開光圈，轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線集中于集光器?？筛鶕?jù)需要，上下移動集光器和縮放光圈，以獲得最佳光度。本次實驗用油鏡檢查染色標(biāo)本，光度宜強(qiáng)。應(yīng)將顯微鏡亮度開關(guān)調(diào)至最亮，光圈完全打開，集光器上升至與載物臺相平。3、 調(diào)焦距：A、 將標(biāo)本片放載物臺上，用標(biāo)本推進(jìn)器固定，將載玻片移至接物鏡下。先用低倍鏡找出標(biāo)本的位置，然后提高鏡筒，在標(biāo)本的待檢部位滴香柏油一滴，再換油鏡觀察。B、 轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使載物臺緩緩上升（或使鏡筒漸漸下降），直至油鏡頭浸沒至油中。此時眼睛應(yīng)從側(cè)面觀察，以免壓碎標(biāo)本片和損壞鏡頭。C、 雙眼移至接目鏡，一面從接目鏡觀察，一面反方向緩慢地轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器（下降載物臺，或上升鏡筒），當(dāng)出現(xiàn)模糊物象時，換用細(xì)調(diào)節(jié)器，轉(zhuǎn)動至物象清晰為止。2、單染色（說明一下我做的是金黃色葡萄球菌）洗片將載玻片用去污粉充分清洗。干燥將涂片于室溫中自然干燥。涂片、固定在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴蒸餾水，點燃酒精燈，在火焰旁邊從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻。手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火2?3次。在火上固定時，用手背試涂片反面的熱度，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞。染色將涂片置于水平位置，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋于涂菌處，染色1-2min。

水洗、干燥傾去染色液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片反面上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止。放于室溫中自然晾干。鏡檢待標(biāo)本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。附：實驗照片顯微鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌（單染色法）（二）細(xì)菌的革蘭氏染色洗片將載玻片用去污粉充分清洗。干燥將涂片于室溫中自然干燥。涂片、固定在載玻片上交錯滴四滴蒸餾水，分別標(biāo)記金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸桿菌和自選菌。然后仿照單染色步驟，分別在四處蒸餾水標(biāo)記的位置加入少量相應(yīng)的菌種，然后在火焰上固定。初染于制片上滴加結(jié)晶紫染液，l.5min后，用水洗去剩余染料。媒染用碘液沖洗載玻片正面，lmin后水洗。脫色滴加95%乙醇脫色30s，水洗。復(fù)染滴加番紅，復(fù)染l.5min，水洗干燥。鏡檢革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。附：實驗照片左一：金黃色葡萄球菌（由于像素不夠高，未能清楚看到聚集的球狀細(xì)胞個體）左二：大腸桿菌右二：枯草芽匏桿菌右一：自選菌（短桿狀個體，目測為革蘭氏陽性菌）五、實驗總結(jié)菌種染色記錄金黃色葡萄球菌紫色枯草芽孢桿