生物化學(xué) 蛋白質(zhì)化學(xué)

生物化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)(總10頁)生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)蛋白質(zhì)的重要性蛋白質(zhì)是機(jī)體最豐富的有機(jī)分子，占人體重量的16~20%，占干重的45%，肺組織高達(dá)80%。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能：生物催化作用、調(diào)節(jié)作用（激素，基因表達(dá)調(diào)控作用）、免疫防御與保護(hù)作用（細(xì)胞因子、補(bǔ)體、抗體）、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存作用（轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、結(jié)構(gòu)功能（保護(hù)和維持細(xì)胞、組織、器官的正常生理形態(tài)，細(xì)胞骨架）、運(yùn)動(dòng)與支撐作用、信息接收傳遞作用（受體蛋白）、生物膜功能蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)組指的是基因組編碼的全部蛋白質(zhì)，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在機(jī)體整體水平上系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)含氮量平均為16%，蛋白質(zhì)的含量=含氮量。天然存在的氨基酸約180種，組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有20余種（基本氨基酸）?；景被岬墓餐攸c(diǎn)：①除脯氨酸為α-亞氨基酸外，其他組成蛋白質(zhì)的基本氨基酸均為α-氨基酸；②除甘氨酸外，其他氨基酸的α-碳原子為手性碳原子，且天然蛋白質(zhì)中基本氨基酸皆為L(zhǎng)-型；③不同的氨基酸的R鏈不同，對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有重要影響。20種常見氨基酸的名稱和結(jié)構(gòu)式（見書P11）氨基酸的分類非極性R基氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸；極性不帶電R基氨基酸（易溶于水）：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；帶負(fù)電的R基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；帶正電的R基氨基酸：賴氨酸、組氨酸、精氨酸。氨基酸的物理性質(zhì)：①高熔點(diǎn)，200℃以上，以離子狀態(tài)存在；②一般均溶于水，溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿；不溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑；③氨基酸一般有味；④除甘氨酸外均有旋光性。氨基酸的化學(xué)性質(zhì)：①兩性解離與等電點(diǎn)：pH高于等電點(diǎn)帶負(fù)電，低于等電點(diǎn)帶正電。等電點(diǎn)時(shí)主要以兩性離子存在，極少量以中性分子存在。中性氨基酸的pI在微酸性范圍，踐行氨基酸的pI在堿性范圍，酸性氨基酸的pI在酸性范圍。②紫外吸收性質(zhì)：色氨酸（280nm）、酪氨酸（275nm）和苯丙氨酸（257nm）含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，具有紫外吸收特性。③茚三酮反應(yīng)：與大多數(shù)α-氨基酸加熱反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)，與脯氨酸、羥脯氨酸反應(yīng)呈黃色，與天冬酰胺反應(yīng)呈棕色；α-羧基的反應(yīng)：與堿、R基的反應(yīng)：Million反應(yīng)（Tyr-紅色）、Folin反應(yīng)（Tyr-藍(lán)色）、坂口反應(yīng)（Arg-紅色）、Pauly反應(yīng)（His、Tyr-橘紅色）、乙醛酸的反應(yīng)（Trp-紫紅色環(huán)）。醇、硼氫化鋰反應(yīng)；氨基酸的功能：①寡肽、多肽、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位；②多種生物活性物質(zhì)的前體；③作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素；④參與生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝和能量代謝。第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：①組成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目；②多肽鏈的氨基酸順序；③多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。體內(nèi)多肽和蛋白質(zhì)生物合成時(shí)，均是從氨基端開始，延長(zhǎng)到羧基端終止，因此N末端被定為多肽鏈的頭。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念：蛋白質(zhì)是由不同種類、數(shù)量和排列順序的氨基酸，通過肽鍵而構(gòu)成的高分子有機(jī)含氮化合物。它是蛋白質(zhì)作用的特異性、空間結(jié)構(gòu)的差異性和生物學(xué)功能多樣性的基礎(chǔ)。活性多肽：谷胱甘肽GSH（還原劑、與毒性藥物結(jié)合、維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、使巰基酶的活性基團(tuán)維持還原狀態(tài)）、降鈣素基因相關(guān)肽（舒血管作用，參與心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)）、肽類激素、多肽類抗生素。蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)：①酸水解:6M鹽酸或4M硫酸，回流20小時(shí)，完全水解；得到L-氨基酸，不引起消旋，色氨酸被破壞，酰胺被水解。②堿水解:5M氫氧化鈉，回流10-20小時(shí)，完全水解；得到等摩爾D-氨基酸L-氨基酸，引起消旋；色氨酸穩(wěn)定。③酶水解:不引起消旋，不破壞氨酸酸，但一種酶水解不徹底，需要幾種酶協(xié)同作用。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的原理及方法：1)氨基酸的組成分析：蛋白質(zhì)樣品的純化→多肽鏈數(shù)目的測(cè)定→氨基酸組成的分析。2)N端氨基酸的分析：①二硝基氟苯法（DNFB）：N末端氨基與DNFB反應(yīng)，生成DNP多肽衍生物；用酸水解，所有肽鍵被水解生成相應(yīng)氨基酸和DNP-末端氨基酸。②二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）：DNS-氨基酸有強(qiáng)烈熒光，靈敏度高。DNFB法和DNS法的不足之處是不能在同一個(gè)肽鏈上重復(fù)應(yīng)用。③Edman降解法（PITC、PTH-氨基酸）：可標(biāo)記并僅水解釋放多肽鏈的N末端氨基酸殘基，留下其他氨基酸殘基的完整肽鏈。④氨肽酶法：肽鏈外切酶，從N端開始逐個(gè)切掉氨基酸。3)C末端氨基酸的分析：①肼解法：多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解，C末端氨基酸以自由形式釋出；②羧肽酶法：特異地從C末端依次將氨基酸水解下來，有A、B、C、Y四種。4)二硫鍵的確定：快原子轟擊、等離子體解吸、電噴霧典禮等軟電離質(zhì)譜技術(shù)。5)大分子多肽氨基酸順序的測(cè)定：先將大分子多肽裂解為小的肽片，經(jīng)分離純化后，分別測(cè)定各肽片的順序。此法適用于無二硫鍵的單鏈多肽組成的蛋白質(zhì)。6)核酸推導(dǎo)法。?蛋白質(zhì)的構(gòu)象：蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及其走向稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象，又稱蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)等。?維持構(gòu)象的化學(xué)鍵（次級(jí)鍵）：氫鍵、疏水鍵、鹽鍵、配位鍵、二硫鍵、范德華力。?蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈的主鏈骨架中若干肽單位，各自沿一定的軸盤旋或折疊，并以氫鍵為主要的次級(jí)鍵而形成有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)僅限于主鏈原子的局部空間排列，不包括與肽鏈其他區(qū)段的相互關(guān)系及側(cè)鏈構(gòu)象。?肽單位：肽鍵與相鄰兩個(gè)α碳原子所組成的基團(tuán)，稱為肽單位或肽平面。肽單位具有以下特性：①肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)；②肽單位上六個(gè)原子處于同一平面；③肽單位中與C-N相連的氫和氧原子與兩個(gè)α碳原子呈反向分布。多肽鏈的盤旋或折疊是由肽鏈中許多α-碳原子的旋轉(zhuǎn)所決定的。?α螺旋：是蛋白質(zhì)中最常見、最典型、含量最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（詳見書P28-29?β折疊：又稱β片層結(jié)構(gòu)。（詳見書P29-30?β轉(zhuǎn)角：又稱β彎曲，是球狀蛋白形成的主要原因。（詳見書P30）））?無規(guī)卷曲：也稱無規(guī)線團(tuán)。不能被歸入明確二級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽區(qū)段，既不是卷曲，也不是完全沒有規(guī)律，有著明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。?超二級(jí)結(jié)構(gòu)（基序、模體或模序）：是指多肽鏈內(nèi)順序上相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體。?結(jié)構(gòu)域：空間結(jié)構(gòu)上相近的幾個(gè)超二級(jí)結(jié)構(gòu)單元進(jìn)一步折疊盤曲而形成的一個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的致密的三維實(shí)體。結(jié)構(gòu)域是三級(jí)結(jié)構(gòu)的一部分，結(jié)構(gòu)域之間靠無規(guī)則卷曲連接。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的獨(dú)立結(jié)構(gòu)單元。?蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置，包含了一條多肽鏈的主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象。具有二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈，由其序列上相隔較遠(yuǎn)而空間上相近的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用，進(jìn)行范圍更廣泛的盤曲折疊而形成包括主、側(cè)鏈在內(nèi)的空間整體排布，稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)。?蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)或兩個(gè)以上的亞基之間相互作用，彼此以非共價(jià)鍵相連而形成構(gòu)象更為復(fù)雜的聚集體結(jié)構(gòu)，成為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。在具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中，每一條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈均被稱為亞基或亞單位，由2~10個(gè)亞基組成的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)稱為寡聚體蛋白。對(duì)稱性是具有四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)之一。維持蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是疏水鍵，位于亞基表面的疏水基側(cè)鏈為了避開水相而相互作用形成疏水鍵進(jìn)而導(dǎo)致亞基的聚合。?蛋白質(zhì)和多肽的化學(xué)合成法：①氨基酸側(cè)鏈活性基團(tuán)的保護(hù)，常用保護(hù)劑是芐氧羰酰氯（Cbz-Cl）和叔丁羰酰氯（BOC-Cl）；②多肽的液相/固相合成。?采用生物技術(shù)合成蛋白質(zhì)：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能?蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系：①一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，其生物學(xué)功能各異。（加壓素和縮宮素）基因突變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，使蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能降低或喪失，甚至可引起生理功能的改變而發(fā)生疾病。這種由遺傳突變引起的、在分子水平上僅存在微觀差異而導(dǎo)致的疾病，稱為分子病。②一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，其基本構(gòu)象及功能也相似。③一級(jí)結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵序列變化，其生物活性或功能發(fā)生改變。?蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和功能的關(guān)系：①蛋白質(zhì)前體的活化。生物體中有許多蛋白質(zhì)是以無活性的蛋白質(zhì)原的形式在體內(nèi)合成、儲(chǔ)存和分泌的，在機(jī)體應(yīng)急或細(xì)胞需要時(shí)，這些蛋白質(zhì)原中某條或某些肽鏈方才以特定的方式斷裂，生成有活性的蛋白，進(jìn)而發(fā)揮他們所特有的生物學(xué)功能。分泌性蛋白質(zhì)除含有特征性的信號(hào)肽或?qū)щ男蛄型?，幾乎所有蛋白質(zhì)都有其前體，即原蛋白，含有信號(hào)肽或?qū)щ幕虿迦腚?，這些需切除的肽段是在蛋白質(zhì)生物合成中生成轉(zhuǎn)運(yùn)以及形成獨(dú)特生理活性所需的空間結(jié)構(gòu)所必需的。但一旦其相應(yīng)的功能完成，肽段便被切除。（胰島素）②蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象。受別構(gòu)劑或配基等因素的影響，其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變而空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，進(jìn)而導(dǎo)致其生物學(xué)功能的改變，稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng)。組成蛋白質(zhì)的各個(gè)亞基共同控制著蛋白質(zhì)分子的生物活性，并對(duì)別構(gòu)劑或配基等信息信號(hào)物做出反應(yīng)，信號(hào)物與一個(gè)亞基的結(jié)合可傳遞到整個(gè)蛋白質(zhì)分子，這個(gè)傳遞是通過亞基構(gòu)象的改變而實(shí)現(xiàn)的。（血紅蛋白）?蛋白質(zhì)空間構(gòu)象改變可引起疾?。阂恍┑鞍踪|(zhì)盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但折疊發(fā)生錯(cuò)誤，使其構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而影響到其正常功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或折疊導(dǎo)致構(gòu)象異常變化而引起的疾病，成為蛋白質(zhì)構(gòu)象病。（朊病毒）第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)?蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)：體內(nèi)多數(shù)蛋白質(zhì)的酸堿氨基酸比例相近，其等電點(diǎn)大多為中性偏酸，約在左右。所以在生理?xiàng)l件下（pH約為），它們大都以負(fù)離子形式存在。?蛋白質(zhì)的變性：天然蛋白質(zhì)分子受環(huán)境因素的影響，從有規(guī)則的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o規(guī)則的松散狀態(tài)，即變性作用。構(gòu)象的破壞是蛋白質(zhì)變性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在某些物理/化學(xué)因素的作用下，蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，進(jìn)而導(dǎo)致其理化性質(zhì)發(fā)生改變和生物活性降低或喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用。蛋白質(zhì)變性作用的本質(zhì)是破壞了形成與穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的各種次級(jí)鍵從而導(dǎo)致其空間構(gòu)象的改變或破壞，并不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變和肽鍵的斷裂。變性作用有以下特征：生物活性喪失和理化性質(zhì)改變（溶解度降低、黏度增加、結(jié)晶能力消失、易被蛋白酶水解）。分可逆變性和不可逆變性。?蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)分子直徑在2~20nm，在溶液中易形成大小介于1~100nm的質(zhì)點(diǎn)。蛋白質(zhì)表面易于發(fā)生水合作用形成水化層，使蛋白質(zhì)顆粒不致聚集而沉淀。蛋白質(zhì)表面具有同性電荷，與周圍的反離子構(gòu)成雙電層。?蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)：①中性鹽沉淀反應(yīng)。逐漸向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽，低鹽濃度可使蛋白質(zhì)溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶，其原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)表面吸附了某種離子，導(dǎo)致其顆粒表面同性電荷增加而排斥加強(qiáng)，同時(shí)與水分子作用也增強(qiáng)，從而提高了其溶解度；隨著鹽濃度的不斷增加，因蛋白質(zhì)水化層的破壞并中和了其表面電荷，而促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，這種現(xiàn)象被稱為鹽析。主要特點(diǎn)是沉淀出的蛋白質(zhì)不變性。②加熱使蛋白質(zhì)凝固變性。③加入有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)表面水化層削弱或破壞并使其介電常數(shù)降低而增加帶電質(zhì)點(diǎn)的相互作用，從而使得蛋白質(zhì)顆粒更易相互聚集沉淀。有時(shí)可引起蛋白質(zhì)變性。④重金屬鹽沉淀反應(yīng)。蛋白質(zhì)在pH大于pI的溶液中呈負(fù)離子，可與重金屬離子結(jié)合成不溶性蛋白鹽或蛋白絡(luò)合物而沉淀。⑤生物堿試劑的沉淀反應(yīng)。蛋白質(zhì)在pH小于pI時(shí)呈正離子，可與生物堿試劑結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。?蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定：蛋白質(zhì)分子量一般為1x104~1x106Da或更高。蛋白質(zhì)在溶液中的形狀可根據(jù)不對(duì)稱常數(shù)分為球形、橢圓形、纖維狀等。①凝膠過濾法。②SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。③生物質(zhì)譜法。（詳見書P48-49）?蛋白質(zhì)分子的免疫學(xué)性質(zhì)。凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的抗體和（或）致敏淋巴細(xì)胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，統(tǒng)稱為抗原。異物性、大分子性、特異性?？乖碳C(jī)體產(chǎn)生能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合并具有免疫功能的免疫球蛋白，稱為抗體。注意抗體與免疫球蛋白之間的區(qū)分。?蛋白質(zhì)免疫性質(zhì)的應(yīng)用：①疾病的免疫預(yù)防：卡介苗、脊髓灰質(zhì)炎糖丸疫苗、白喉類毒素、乙肝的基因工程疫苗等；②疾病的免疫診斷：α-甲胎蛋白診斷肝癌，血型、HBsAg檢測(cè)等；③疾病的免疫治療：破傷風(fēng)抗毒素、狂犬病毒抗血清、抗蛇毒抗毒素、胸腺素和干擾素等，單克隆抗體也常作為靶向藥物載體用于腫瘤治療；④免疫分析：免疫擴(kuò)散、免疫電泳；⑤標(biāo)記免疫分析：放射免疫分析（RIA）、酶聯(lián)免疫分析（EIA）、熒光標(biāo)記免疫分析等；⑥免疫分離純化：免疫親和層析。?蛋白質(zhì)的紫外吸收：由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。蛋白質(zhì)濃度mg/ml＝-?蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)：①茚三酮反應(yīng)。蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物。②雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與分析基本原理?蛋白質(zhì)的提?。涸黾拥鞍椎募兌龋栽黾訂挝坏鞍踪|(zhì)中所需要的蛋白質(zhì)重量和生物活性。既要盡量提取所需目標(biāo)的蛋白質(zhì)，又要防止蛋白酶等的降解和其他因素對(duì)其空間構(gòu)象的破壞作用。?根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異分離：①等電點(diǎn)沉淀。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。單純使用此法不易使蛋白質(zhì)沉淀完全，常與其他方法配合使用。鹽析法。是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素被去除沉淀。優(yōu)點(diǎn)：沉淀的蛋白質(zhì)保持著它的天然構(gòu)象，能再溶解。③有機(jī)溶劑分級(jí)分離法。是將有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇）加入蛋白質(zhì)溶液中，導(dǎo)致溶液介電常數(shù)降低，增加了相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)分子表面可解離基的離子化強(qiáng)度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。注意事項(xiàng)：使用丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃下進(jìn)行。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，防止變性。④溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響。一般在0～40℃，多數(shù)球狀蛋白的溶解度隨溫度的升高而增加；40～50℃以上，多數(shù)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定并開始變性。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀一般要求低溫條件。?根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量差異分離：①透析及超濾法。透析指利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)。超過濾指應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。用于除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)。②凝膠過濾法。也稱分子排阻層析，層析柱內(nèi)填滿帶有小孔的顆粒，一般由葡聚糖制成。蛋白質(zhì)溶液加于柱頂部，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，因而在柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)而徑直流出，因此不同大小的蛋白質(zhì)得以分離。分子篩：具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。常用分子篩有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。③密度梯度離心。蛋白質(zhì)顆粒的沉降速度取決于它的大小和密度。當(dāng)其在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停滯不前，可分步收集進(jìn)行分析。?根據(jù)蛋白質(zhì)的電離性質(zhì)差異分離：①電泳法。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳。在蛋白質(zhì)樣品和聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入帶負(fù)電荷較多的十二烷基磺酸鈉（SDS），使所有蛋白質(zhì)顆粒表面覆蓋有一層SDS分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的電荷差異消失，此時(shí)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率僅與蛋白質(zhì)顆粒大小有關(guān)。常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。SDS的作用：a.由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來的電荷差異。是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都相同，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度隨其分子量的大小成正比變化。B.醋酸纖維薄膜電泳。它以醋酸纖維薄膜作為支持物，電泳效果比紙電泳好，時(shí)間短、電泳圖譜清晰。臨床用于血漿蛋白電泳分析。C.等電聚焦電泳。在聚丙烯酰胺凝膠中加入系列兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)中形成一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，也即pH從凝膠的正極向負(fù)極依次遞增，電泳時(shí)被分離蛋白質(zhì)處在偏離其等電點(diǎn)的pH位置時(shí)帶有電荷而移動(dòng)，至該蛋白質(zhì)pI值相等的pH區(qū)域時(shí)，其