修改第第十三章植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立課件

第十三章

植物遺傳轉(zhuǎn)化體系建立

第一頁，共二十頁。第一節(jié)植物基因轉(zhuǎn)化的受體體系

轉(zhuǎn)基因植物是指利用重組DNA技術(shù)將外源優(yōu)良目的基因整合到植物的基因組中，并使其得以表達，從而獲得具有新的遺傳性狀的植物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎是良好的受體體系，因此，建立了高效穩(wěn)定的受體體系，才能進行植物轉(zhuǎn)基因的操作和應用。第二頁，共二十頁。植物基因轉(zhuǎn)化的受體體系是指將用于基因轉(zhuǎn)化的外植體---利用組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑，建立高效、穩(wěn)定并能接受外源基因的整合以及對轉(zhuǎn)化篩選抗生素較敏感的再生系統(tǒng)。良好的基因轉(zhuǎn)化的受體體系的建立是成功實現(xiàn)觀賞植物遺傳轉(zhuǎn)化的基礎，而合適的轉(zhuǎn)化受體體系要有高效穩(wěn)定的再生能力。

第三頁，共二十頁。理想的受體材料是：

細胞既要能有效地接受外源目的基因，還應由單細胞分化再生植株，減少假陽性植株和嵌合體。目前常用的外植體有原生質(zhì)體、懸浮細胞、愈傷組織、胚狀體、葉圓盤、葉片、莖段、下胚軸、無性胚等。

其次，受體材料的特性，包括受體材料的生理狀態(tài)，受體的再生能力和再生途徑，體細胞無性系變異的發(fā)生等。

第四頁，共二十頁。

再次，適宜的誘導和篩選條件，如培養(yǎng)基種類和組成，篩選劑種類、濃度，篩選時間等都會影響到轉(zhuǎn)基因細胞的分化和抗性植株再生。

最后，觀賞植物基因轉(zhuǎn)化的受體體系要有較高的遺傳穩(wěn)定性，要求受體系統(tǒng)在接受外源DNA后不應影響其正常的生長、分裂、發(fā)育、分化，并能穩(wěn)定地將接受的外源DNA遺傳給后代，盡量減少變異。

第五頁，共二十頁。一、直接分化受體體系

是外植體直接分化出不定芽獲得再生植株而建立的受體體系。

①獲得再生植株的操作簡單，周期短。

②體細胞無性系變異小，獲得的再生植株其遺傳性質(zhì)十分穩(wěn)定，特別是由莖尖分生組織經(jīng)過直接分化建立的再生系統(tǒng)其遺傳穩(wěn)定性更佳。

但通常由外植體直接分化成芽難度較大，再生頻率較低。同時不定芽的再生常常起源于多細胞，容易存在嵌合體。第六頁，共二十頁。二、愈傷組織

愈傷組織受體體系是外植體經(jīng)過脫分化形成愈傷組織再獲得再生植株而建立的受體體系。

①由分生細胞組成，易于接受外源目的DNA，轉(zhuǎn)化效率較高。

②繁殖系數(shù)迅速增加，可以獲得大量的轉(zhuǎn)化植株。

③適合于通過直接分化難以獲得再生植株的植物和相應的外植體，特別是單子葉植物和木本植物。

愈傷組織通常是由多細胞組成的，易產(chǎn)生嵌合體；同時獲得的再生植株無性系變異較大，外源基因整合的穩(wěn)定性較差。第七頁，共二十頁。三、原生質(zhì)體

在進行植物遺傳轉(zhuǎn)化之前要盡可能選取與母本遺傳一致的外植體來建立有效的再生體系。原生質(zhì)體是植物遺傳轉(zhuǎn)化中應用最廣的、理想的受體材料之一。

特點有：

①去除了細胞壁的阻礙，能夠直接高效地接受外源DNA并整合到染色體上。

第八頁，共二十頁。②原生質(zhì)體生理生化特性幾乎一致，便于在相對均勻、穩(wěn)定的同等條件下實現(xiàn)目的基因的表達、轉(zhuǎn)化、鑒定。

③原生質(zhì)體經(jīng)過培養(yǎng)易于形成基因型一致的細胞系，較易避免嵌合體的產(chǎn)生，性狀也易純化且穩(wěn)定遺傳。

④受體體系可適合于多種轉(zhuǎn)基因方法。

但原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)要求高、過程復雜、周期長，獲得再生植株的頻率較低；同時原生質(zhì)體培養(yǎng)形成的細胞無性系變異強烈，再生植株變異頻率較高，限制了原生質(zhì)體作為遺傳轉(zhuǎn)化受體的應用。第九頁，共二十頁。四、懸浮細胞

基因轉(zhuǎn)化的受體體系的特點是：

①生長迅速，重復性好，易于接受外源DNA，轉(zhuǎn)化效率較高。

②懸浮細胞主要是由單細胞、小細胞團組成，可有效克服轉(zhuǎn)基因植株中存在的嵌合體現(xiàn)象。

③懸浮細胞培養(yǎng)條件易于控制，便于進行轉(zhuǎn)化體的篩選。

但建立良好的細胞懸浮系受植物基因型的影響較大，且耗時較長，一般需要3～6個月時間。同時隨著繼代培養(yǎng)時間的延長，胚性懸浮細胞的再生能力會逐漸喪失，并導致突變體的產(chǎn)生。第十頁，共二十頁。五、胚狀體

體細胞胚發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點，同時體細胞胚的產(chǎn)生起源于單細胞，能在突變體育種和基因重組育種中克服嵌合體現(xiàn)象。體細胞胚受體體系的特點是：

1.發(fā)育成胚狀體的胚性細胞具有較強的分裂特性和接受外源目的DNA的能力，是理想的基因轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，同時這些胚性細胞繁殖量大，同步性好，轉(zhuǎn)化效率高。第十一頁，共二十頁。2.胚狀體的發(fā)生是單細胞起源，因此獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少。

3.胚狀體具有兩極性，即在發(fā)育過程中能同時分化出芽和根，克服了某些植物由不定芽難以生根的缺陷。第十二頁，共二十頁。4.與植物器官再生方式相比，胚狀體發(fā)生速度快、數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整、再生率高，胚狀體個體間的遺傳背景一致，不容易產(chǎn)生變異，使獲得的轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性好。

5.與周圍細胞存在隔離區(qū)，和培養(yǎng)物沒有維管束聯(lián)系，容易從培養(yǎng)物上剝離。

6.利用胚狀體可生產(chǎn)人工種子。第十三頁，共二十頁。六、生殖細胞受體體系（種質(zhì)系統(tǒng)）

利用植物的生殖細胞如花粉粒、卵細胞等為受體細胞進行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)叫生殖細胞受體系統(tǒng)，也稱種質(zhì)系統(tǒng)。

目前主要通過兩個途徑建立生殖細胞受體系統(tǒng)。

1、利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)，通過誘導出胚性細胞或愈傷組織，獲得單倍體植株，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體體系。

2、直接利用花粉和卵細胞受精、發(fā)育過程進行遺傳轉(zhuǎn)化，如花粉管通道法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。第十四頁，共二十頁。生殖細胞基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的特點有：

①生殖細胞再生能力強，接受外源目的基因的能力也強，轉(zhuǎn)化效率高。

②生殖細胞是單倍體細胞，轉(zhuǎn)化的基因無顯隱性影響，能提高外源基因的表達效率，有利于性狀的選擇。通過加倍后能獲得純合的二倍體。

③跟傳統(tǒng)的育種技術(shù)結(jié)合，能縮短復雜的育種純化過程，簡化種質(zhì)創(chuàng)新程序。

④易于獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。第十五頁，共二十頁。第二節(jié)植物基因轉(zhuǎn)化的方法

一、載體轉(zhuǎn)化方法

（一）根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法

根癌農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段可轉(zhuǎn)移的DNA（T-DNA），農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，而T-DNA插入外源DNA片段并不影響整合。第十六頁，共二十頁。（二）植物病毒法

植物病毒作為潛在的轉(zhuǎn)化載體，具有易于浸染、拷貝數(shù)多和啟動外源基因表達能力強的特點，因而引起人們的極大興趣，其中最有希望的是花椰菜花葉病毒（CaMV），已有實驗證明它能進入宿主細胞并得以擴增及傳播。第十七頁，共二十頁。二、DNA理化轉(zhuǎn)移方法不依賴于農(nóng)桿菌載體和其他生物媒體，將經(jīng)過特殊處理的裸露外源DNA直接導入植物細胞，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法叫DNA直接導入的轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化技術(shù)根據(jù)原理可分為物理法和化學法2種。物理法是基于諸多物理因素對細胞膜的影響，或通過機械損傷直接將外源DNA導入細胞，；化學法借助于特定的化學物質(zhì)誘導DNA直接導入植物細胞。第十八頁，共二十頁。第三節(jié)轉(zhuǎn)基因植株再生及檢測

一、轉(zhuǎn)基因植株再生

植物轉(zhuǎn)基因方法眾多，轉(zhuǎn)基因植株的再生方法也各異。第十九頁，